Este protocolo detalha um método para a dissecção de depósitos adiposos de camundongos e o isolamento e digestão das respectivas artérias para liberar e, em seguida, identificar a população de células endoteliais. Células recém-isoladas usadas em aplicações a jusante avançarão na compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.
As células endoteliais vasculares que revestem a parede do sistema vascular desempenham papéis importantes em uma variedade de processos fisiológicos, incluindo regulação do tônus vascular, funções de barreira e angiogênese. A disfunção das células endoteliais é um preditor característico e um dos principais impulsionadores da progressão de doenças cardiovasculares graves, mas os mecanismos subjacentes permanecem pouco compreendidos. A capacidade de isolar e realizar análises em células endoteliais de vários leitos vasculares em sua forma nativa dará uma visão sobre os processos de doenças cardiovasculares. Este protocolo apresenta o procedimento para a dissecção dos tecidos adiposos subcutâneo e mesentérico de camundongos, seguido do isolamento de suas respectivas vasculaturas arteriais. As artérias isoladas são então digeridas usando um coquetel específico de enzimas digestivas focadas na liberação de células endoteliais funcionalmente viáveis. O tecido digerido é avaliado por análise de citometria de fluxo utilizando células CD31+/CD45− como marcadores para identificação positiva de células endoteliais. As células podem ser classificadas para ensaios funcionais imediatos a jusante ou usadas para gerar linhas celulares primárias. A técnica de isolar e digerir artérias de diferentes leitos vasculares fornecerá opções para os pesquisadores avaliarem células vasculares recém-isoladas de artérias de interesse e permitir que eles realizem uma ampla gama de testes funcionais em tipos específicos de células.
As células endoteliais são bem reconhecidas por seus papéis importantes em uma variedade de processos fisiológicos, incluindo funções de barreira, angiogênese e regulação do tônus vascular 1,2. Embora a disfunção das células endoteliais esteja bem documentada na promoção da aterosclerose, hipertensão, diabetes, etc., os mecanismos subjacentes que impulsionam a disfunção endotelial permanecem pouco compreendidos e provavelmente diferem entre leitos vasculares distintos 2,3,4. O esforço para desvendar esses mecanismos patológicos de disfunção das células endoteliais é desafiado pelo acesso limitado a uma população pura de células endoteliais a partir de tecidos e/ou pelas alterações fenotípicas das células endoteliais em cultura 5,6. Portanto, ser capaz de isolar e realizar análises em células endoteliais de vários leitos vasculares em sua forma nativa dará uma visão sobre os processos de doença cardiovascular.
Este protocolo apresenta o procedimento de dissecação dos tecidos adiposos subcutâneo e mesentérico de camundongos, seguido do isolamento de suas respectivas vasculaturas arteriais. Células endoteliais funcionalmente viáveis que revestem as paredes arteriais são liberadas usando um coquetel específico de enzimas. Cuidados especiais foram tomados para otimizar as condições do protocolo de digestão para obter um rendimento suficiente de células endoteliais a partir de <1 mg de tecido inicial, mantendo os marcadores biomoleculares intactos para análise. As células endoteliais isoladas são identificadas em seguida usando citometria de fluxo. A presença de CD31 (PECAM) é usada principalmente para identificar células endoteliais. Devido à expressão de CD31 em outros tipos celulares, incluindo várias de origem hematopoiética que também expressam CD45, a pureza das células endoteliais isoladas foi ainda aumentada pela exclusão de células que expressam CD31 e CD45 5,6,7,8. Além disso, dependendo da questão de pesquisa e das aplicações a jusante a serem empregadas, os pesquisadores devem considerar a seleção de um extenso painel de marcadores de seleção positivos e negativos para otimizar a pureza da população celular de interesse.
Embora a técnica de dissecação e isolamento de artérias adiposas tenha sido utilizada nas publicações anteriores 9,10,11,12,13, um protocolo detalhado descrevendo o isolamento de artérias embutidas ainda não foi apresentado. Demonstrar a técnica para o isolamento e digestão de artérias de diferentes leitos vasculares de uma determinada espécie de interesse fornecerá opções para os pesquisadores avaliarem células vasculares recém-isoladas de artérias de interesse e permitir-lhes realizar uma ampla gama de testes funcionais em tipos específicos de células. Os testes podem incluir, mas não estão limitados a, citometria de fluxo para classificação celular e expressão de proteínas de membrana5,8, eletrofisiologia para atividade de canais iônicos9, perfil molecular (análises proteômicas/genômicas, etc.) 14,15 e a geração de linhagens celulares primárias para triagem de fármacos in vitro16,17.
A disfunção endotelial é precursora de estados graves da doença, provavelmente impulsionando o desenvolvimento de aterosclerose, hipertensão e acidente vascular cerebral 3,23. Embora os mecanismos identificados subjacentes à disfunção endotelial em uma determinada condição patológica sejam muitos, leitos vasculares distintos provavelmente serão diferencialmente influenciados por condições patológicas 4,24. Além disso, diferentes fatores de risco cardiovascular (por exemplo, obesidade, hipertensão, dislipidemia, tabagismo, diabetes) induzem disfunção por meio de uma variedade de mecanismos distintos23,25. Portanto, é fundamental isolar populações de células endoteliais de modelos animais estabelecidos de doença ou tecido humano acessível e realizar ensaios em células imediatamente removidas do ambiente de vivo. O isolamento de células dessa maneira tem uma vantagem única sobre o estudo de células em cultura, na medida em que elas são vazias de alterações fenotípicas induzidas pela cultura 5,6. Além disso, a inclusão de uma população heterogênea de células endoteliais, como observado in vivo 26,27 (e que pode ser separada ainda mais usando a classificação celular assistida por fluxo), de um organismo vivo informa melhor o ambiente in vivo. Finalmente, este método é aplicável à investigação de numerosos modelos animais e tecidos potencialmente humanos e pode ser usado para gerar linhagens de cultura celular primária, se tal necessidade for justificada.
A etapa crítica deste protocolo, e a etapa que mais precisará de ajustes para diferentes leitos vasculares ou tipos de células não apresentados aqui, é a digestão do tecido vascular. Esta etapa deve ser otimizada para a saúde celular sem diminuir o rendimento celular. As enzimas específicas utilizadas e a duração da digestão são fundamentais para otimizar a saúde celular e o rendimento para poder realizar adequadamente os ensaios a jusante. Para a identificação da expressão de membrana de CD36, detectada por citometria de fluxo em células endoteliais subcutâneas e mesentéricas (Figura 4), foi desenvolvida uma versão modificada do protocolo de digestão originalmente projetado para a eletrofisiologia patch-clamp28 . Isso incluiu uma extensão do tempo de digestão da colagenase I para 30 minutos para aumentar o rendimento celular para melhor atender às demandas de citometria de fluxo versus o que é necessário para estudos de patch-clamp. Como essa modificação pode afetar a saúde celular até certo ponto, uma coloração de viabilidade celular foi utilizada nas análises de citometria de fluxo para garantir que apenas células endoteliais viáveis fossem avaliadas seguindo esse protocolo (Figura 3). Recomenda-se que os estudos destinados a isolar células do tecido vascular incluam um marcador de viabilidade celular antes de avaliar a abordagem desejada.
O protocolo descrito é suficiente para liberar células endoteliais viáveis para análise e aplicações a jusante de amostras arteriais de ≤1 mg derivadas de camundongos; no entanto, se as artérias de interesse fossem isoladas de diferentes tecidos ou organismos (por exemplo, humanos) que resultariam em massas arteriais significativamente diferentes, seria necessário otimizar o conteúdo de enzimas de digestão e a duração da incubação para isolar eficientemente a população celular de interesse. Para alguns leitos vasculares que começam com quantidades ainda menores de tecido inicial do que os leitos subcutâneos e mesentéricos apresentados aqui (por exemplo, artérias coronárias), o agrupamento de artérias de vários camundongos pode ser necessário por amostra. De fato, este pode ser um passo necessário para qualquer leito vascular, uma vez que a abordagem de resultado requer um rendimento celular relativamente alto. Uma grande limitação é que, devido à natureza das variações por digestão da amostra, os rendimentos celulares às vezes podem ser significativamente diferentes entre os lotes, mesmo quando do mesmo leito vascular. Isso pode causar problemas ao analisar dados e deve ser contabilizado por meio da normalização, quando apropriado. Por exemplo, a expressão de CD36 foi extremamente variável nos dados brutos devido a alterações nos rendimentos celulares em amostras individuais de artérias adiposas subcutâneas e mesentéricas. Portanto, os dados brutos foram normalizados para a intensidade média de fluorescência CD31+CD45− com a suposição de que esse método corrigiria as diferenças de lote (Figura 4). É claro que, dependendo da abordagem, análises estatísticas mais sofisticadas e métodos de normalização podem ser necessários.
Em resumo, este trabalho apresenta um método para dissecar, isolar e digerir artérias subcutâneas e mesentéricas de camundongos para investigar a expressão e/ou função de alvos endoteliais de interesse. Com modificações no protocolo apresentado, diferentes leitos vasculares e tipos de células (por exemplo, células musculares lisas) podem ser investigados. Este protocolo, como base para uma infinidade de abordagens experimentais disponíveis, tem o potencial de avançar a compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.
The authors have nothing to disclose.
Em memória amorosa de Rich West, um brilhante cientista, colega e querido amigo. Gostaríamos de agradecer à Citometria de Fluxo da Universidade de Delaware e ao Núcleo de Bioimagem como parte do Instituto de Biotecnologia de Delaware por suas contribuições contínuas para nossos estudos. Também gostaríamos de agradecer a Emma Hudgins pela cuidadosa revisão e edição do manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Este projeto também foi apoiado pelo programa Delaware INBRE, com uma bolsa do NIGMS (P20GM103446) dos Institutos Nacionais de Saúde e do Estado de Delaware (I.S. Fancher), e uma bolsa de Pesquisa da Universidade Geral de Delaware (I.S. Fancher). Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |