从不同的脂肪库分离和鉴定血管内皮细胞，用于下游应用

在这些研究中使用动物得到了特拉华大学机构动物护理和使用委员会（#1372）的批准。 1. 组织解剖和清洁 注意：视频协议中使用10至12周龄的C57BL / 6J小鼠。有关组织解剖和清洁动脉的示意图和预期结果，请参阅 图1 ，有关耗材和制造商信息的列表，请参阅 材料表 。 通过CO2 窒息然后颈椎脱位对小鼠实施安乐死。 使用解剖针固定鼠标，并用70%乙醇喷洒腹面。 分离位于每个后肢的皮下脂肪组织注意：需要解剖工具：直波恩剪刀（9厘米）和钝弯曲的格雷夫镊子。使用镊子将皮肤抬起生殖器正上方，并在皮肤上做一个小切口（2 毫米）。 将剪刀的尖端插入切口部位，做一个4-5厘米的中线切口，从最初的切口开始，颅骨解剖到胸骨的底部。小心不要穿透腹腔。 做一个1厘米的侧切口，从前肢正下方的中线横向延伸。 在后肢和生殖器之间做一个1厘米的对角线切口。 沿着中线皮肤切口做小切口，剥去相关的结缔组织并露出皮下脂肪库。将皮肤向下固定。 识别垂直于腹腔的“C 形”皮下脂肪组织和动脉/静脉。 从靠近生殖器的C形底部开始，轻轻抓住脂肪组织，露出结缔组织。在结缔组织中做小切口，将脂肪与皮肤分离。避免干扰暴露的脉管系统。 继续解剖结缔组织，直到皮下脂肪组织可以完整切除。小心地将暴露的动脉与周围的结缔组织分开。 将分离的皮下脂肪储存在冰上的HEPES缓冲液中，直到准备好分离感兴趣的血管床。 重复步骤 1.3.3.-1.3.5。对于剩余的后皮下脂肪库。 肠系膜脂肪库的分离注意：需要解剖工具：直波恩剪刀（9 厘米）、格雷夫镊子、一对 #5 镊子、直虹膜剪刀和弯曲波恩剪刀（9 厘米）。使用格雷夫镊子将薄腹腔壁抬高到膀胱上方，并使用直剪刀做一个小切口。 慢慢提起穿透的腹膜腔壁，小心地将直虹膜剪刀插入切口部位，从膀胱到胸骨做一个4-5厘米的切口。 用直虹膜剪刀做两个1厘米长的水平切口，从中线横向延伸到后肢上方和前肢下方。使用格雷夫镊子剥离腹部肌肉组织并暴露腹膜内脏。 重复步骤 1.4.3。在对面。 使用一对#5镊子将肠子从内脏腔中取出，以露出肠系膜脂肪。 使用弯曲的剪刀和#5镊子沿着结肠分离脂肪，从盲肠开始到结肠从视野下降的地方。 返回盲肠，使用弯曲的剪刀和#5镊子将脂肪沿着小肠分离到胰腺。切除胰腺的一小部分以完全隔离肠系膜脂肪。注意：切除一小部分胰腺和肠系膜脂肪可能有助于清洁动脉，因为它在清洁过程中提供稳定性。 将分离的肠系膜脂肪储存在冰上的HEPES缓冲液中，直到准备好分离肠系膜动脉。 从皮下和肠系膜脂肪组织中分离相应的动脉注意：需要解剖工具：带光源的解剖盘和立体镜，一对#55镊子和一对#5镊子。将~10 mL冷HEPES缓冲液放入解剖盘中，并使用#5镊子将脂肪组织转移到培养皿中。 使用1倍放大倍率的立体镜查看和定位脂肪组织以暴露动脉/静脉对（图2）。 使用#55镊子小心地从动脉中取出实质脂肪。一次去除小块脂肪，并在立体镜下仔细观察动脉/静脉对，以识别并避免损坏感兴趣的脉管系统。注意： 相应地调整放大倍数和光源以清洁动脉。增加放大倍数和光强度，以便在去除脂肪时更好地观察动脉。动脉的精细清洁应在4x-5x放大镜下进行。区分结缔组织（胶原蛋白）、静脉和动脉很重要。结缔组织和胶原纤维具有无分支的弦状外观，有条纹，颜色发白。与胶原纤维和结缔组织不同，动脉和静脉是透明的，并且具有多个分支和明确的管腔。小动脉和静脉在无实质组织时可能看起来相似。管腔中血液的存在可以进一步帮助人们从静脉中识别动脉。与同等大小的动脉相比，静脉具有更薄的血管壁和更大的管腔，并且含有更多的血液。 重复步骤 1.5.3。直到动脉完全没有实质脂肪组织。 使用#5镊子将清洁的动脉转移到带有新鲜HEPES缓冲液的新管中，并保持在冰上直到准备好消化。 2.消化分离动脉以分离内皮细胞 注意：请参阅 图2 ，了解组织消化和内皮细胞分离的示意图，以及材料 表 ，了解该方案所需的耗材的完整列表。 向每个 2 mL 微量离心管中分别加入 1 mg 分散酶和弹性蛋白酶。向每个试管中加入 2 mL 解离溶液。涡旋并在37°C孵育直至完全溶解。使用#5镊子将清洁的动脉（步骤1.5.5.）转移到相应的样品管中。每种酶的最终浓度为0.5mg/mL。 在37°C下孵育1小时，每10-15分钟通过倒置轻轻搅拌，使得动脉悬浮在溶液中以保持酶和动脉之间的一致和均匀接触。 称取每个样品1mg的I型胶原酶，并将其添加到新管中。 让动脉沉淀在管子底部。在不干扰动脉的情况下从顶部取出 500 μL 缓冲液，并将其转移到含有胶原酶的指定管中。涡旋并将溶液返回到原始样品管中的相应样品中。I型胶原酶的最终浓度为0.5毫克/毫升。 在37°C孵育15分钟。确保在样品管短暂摇晃后动脉分离成碎片。如果动脉在扰动后没有分离成碎片，则以 5 分钟为增量孵育，直到可见动脉破裂。 使用玻璃移液管，用力研磨消化的组织10x-15x以机械方式解离细胞。 将溶液和消化的组织通过70μm细胞过滤器或流式细胞术管过滤器以获得单细胞悬液。 3. 流式细胞术前内皮细胞染色 注意：除非有指示，否则内皮细胞的染色和处理在冰上进行以提高细胞活力。将 5 mL 聚苯乙烯圆底管在室温 （RT） 下以 1，163 x g 离心 3 分钟。 在室温下以1，163×g离心单细胞悬液3分钟。 除去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL PBS + 5%BSA中，在室温下重悬30分钟。注意：研究人员应考虑阻断FC受体，具体取决于细胞类型，感兴趣的靶标和使用的抗体18，19。 加入 1 μL 细胞活力染色剂（405 nm 激发）（材料表），并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。 在室温下以 1，163 x g 离心细胞悬液 3 分钟。 将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS + 1% BSA 中。 向样品中加入与CD31（CD31-PE，0.75μg/样品）和CD45（CD45-FITC，2.5μg/样品）偶联的一抗，并在用铝箔覆盖样品后在冰箱的摇杆上孵育15分钟。注意：要鉴定和/或获得纯的内皮细胞群，请使用具有不同激发/发射荧光的CD31和CD45偶联一抗以及具有CD31 + CD45−表达谱的门/分选细胞来探测CD31和CD45。根据所使用的荧光团18，20，21，可能需要补偿。 通过将 1 mL PBS + 1% BSA 直接添加到细胞悬液中来洗涤细胞。 在室温下以 1，163 x g 离心细胞悬液 3 分钟。 除去上清液并重悬于 200 μL 含有 0.1% BSA 的 1% 甲醛中。存放在用铝箔覆盖的冰箱中，直到准备好进行流式细胞术。注意：通过减少洗涤和离心步骤来提高细胞产量。这些可能需要根据结果方法进行更改。固定剂中的样品应在24小时内进行分析。