Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Прослеживание линии индуцируемых флуоресцентно меченых стволовых клеток в мозге взрослой мыши

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

Способность постоянно маркировать стволовые клетки и их потомство флуорофором с использованием индуцируемой трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, позволяет проводить пространственный и временной анализ активации, пролиферации, миграции и / или дифференцировки in vivo. Трассировка родословной может выявить новую информацию о приверженности линии, реакции на вмешательство (вмешательства) и мультипотентности.

Abstract

Линия обратной транскриптазы теломеразы (Tert) была разработана для исследования поведения и судьбы взрослых тканевых стволовых клеток путем пересечения системы «Tet-On» oTet-Cre мыши с новым трансгеном обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), связанным с промотором Трета, который, как мы продемонстрировали, отмечает новую популяцию взрослых стволовых клеток мозга. Здесь введение тетрациклинового производного доксициклина мышам mTert-rtTA::oTet-Cre позволит неизгладимо отметить популяцию клеток, экспрессирующих 4,4 кб фрагмента промоторной области гена Tert. При объединении репортера Rosa-mTmG мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG будут экспрессировать мембранный tdTomato (mTomato) до тех пор, пока лечение доксициклином не вызовет замену экспрессии mTomato мембраной EGFP (mGFP) в клетках, которые также экспрессируют Tert. Поэтому, когда эти мыши с тройной трансгенной линией, отслеживающие линию, получают доксициклин («импульсный» период, в течение которого отмечаются TERT-экспрессирующие клетки), эти клетки станут неизгладимо маркированными клетками mGFP+, которые можно отслеживать в течение любого желаемого периода времени после удаления доксициклина («период погони»), даже если экспрессия Tert впоследствии теряется. Затем мозг фиксируется перфузией и обрабатывается для иммунофлуоресценции и других последующих применений, чтобы интерпретировать изменения в активации стволовых клеток, пролиферации, приверженности родословной, миграции в различные ниши мозга и дифференцировки к зрелым типам клеток. Используя эту систему, любая мышь rtTA может быть соединена с oTet-Cre и репортером Rosa для проведения экспериментов по отслеживанию линий с использованием маркеров стволовых клеток, индуцируемых доксициклином.

Introduction

Значение линии мыши трассировки линии
Анализ стволовых клеток in vivo может быть затруднен, поскольку многие анализы, которые исследуют такие клетки, сосредоточены только на характеристике этих клеток в момент смерти животного, что представляет собой конечный снимок во времени. Чтобы лучше понять процессы пролиферации, дифференцировки и миграции предшественников, промежуточных / переходных типов клеток и зрелых клеток с течением времени, требуется подход продольного анализа. Это может быть достигнуто с помощью исследований трассировки линии, в результате которых стволовые /прогениторные клетки маркируются неизгладимо и могут отслеживаться в течение любого периода времени после1.

В мозге взрослых млекопитающих процесс нейрогенеза, посредством которого взрослые нейроны создаются из стволовых и прогениторных клеток, был впервые проанализирован путем удержания меток тимидином-Н3 2,3,4 или 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU)5,6,7,8 . В этих исследованиях пролиферативные клетки были отмечены аналогом тимина, который был включен в ДНК клеток во время репликации и деления/пролиферации клеток. Отмеченные клетки, а также их потомство, следовательно, содержали этот аналог, который затем был идентифицирован посмертно. Однако, в то время как тимидин-Н3 и BrdU позволяли маркировать пролиферативные клетки и их потомство в областях мозга, где стволовые клетки были плохо изучены, этим исследованиям препятствовали недостатки этих инструментов. Тимидин-Н3 индуцирует остановку клеточного цикла, апоптоз и дозозависимое ингибирование синтеза ДНК9, в то время как BrdU маркирует клетки на различных уровнях в зависимости от пути введения10 и поглощается клетками во время репарации или апоптоза, а также во время деления клеток11. В последнее время используются более эффективные методы маркировки, такие как маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), но многие из тех же проблем, что и BrdU, все еще остаются12. Эти подходы также ограничиваются тем, что они отмечают любую пролиферативную клетку, а не только стволовые клетки, и, таким образом, интерпретация результатов может быть сбита с толку. В нейрогенной линии все стволовые и прогениторные клетки сохраняют митотическую способность, и только терминальные/зрелые нейроны не являются пролиферативными. Для астроцитов и микроглии, но не олигодендроцитов, пролиферация сохраняется неопределеннодолго 13,14,15.

Трансгенные мыши, используемые для отслеживания только клеток, которые экспрессируют интересующий белок, например, подтвержденный для идентификации взрослых стволовых клеток, как мы используем здесь, поэтому стали более распространенными при исследовании стволовых клеток и их потомства. Несмотря на то, что их трудно генерировать с помощью мышиных трансгенных подходов, линии отслеживания линий мыши позволяют отслеживать специфически отмеченные клетки в мозге и не полагаются только на пролиферацию. В трансгенной мышиной системе Tet-On введение тетрациклина или доксициклина (производного тетрациклина) индуцирует экспрессию cre-рекомбиназы в клетках, которые были спроектированы с помощью обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), который транскрибируется интересующим промотором. Тет-индуцируемая Cre-управляемая рекомбинация затем активирует экспрессию несмываемого флуоресцентного или люминесцентного белка в интересующих клетках, в зависимости от используемой мыши Rosa-reporter. Эти неизгладимо отмеченные клетки продолжают экспрессировать этот репортер после деления, дифференцировки или миграции, что позволяет отслеживать эти клетки и их потомство с течением времени или после различных вмешательств16. Преимущества трансгенных подходов к отслеживанию линий включают: 1) специфичность отслеживания конкретной клеточной линии или предшественника/стволовой клетки, отмеченной rtTA, 2) несмываемую экспрессию флуоресцентного или люминесцентного белка, несмотря на клеточный оборот или дифференцировку, 3) низкую токсичность, 4) условную активацию в любой точке жизненного цикла животного и 5) простоту использования с общими анализами, включая иммуноокрашивание/иммунофлуоресценцию16.

Другие методы индуцируемых во времени репортерных инструментов у мышей включают использование мышей Cre-ERT2, которые могут быть сопряжены с ROSA-GFP, ROSA-mTmG или другими флуоресцентными репортерными трансгенами. У этих животных клеточно-специфический регуляторный элемент, такой как интересующая промоторная или энхансерная область, стимулирует выработку рекомбиназы Cre, которая может быть активирована только путем введения тамоксифена. В то время как мышиные линии Cre-ERT2 позволяют индукцию Cre в определенных клеточных линиях, существует множество знаний, подробно описывающих влияние тамоксифена на нейрогенез взрослых17,18. Кроме того, существует много управляемых ROSA флуоресцентных репортерных генов, которые могут быть использованы вместо GFP или mTmG, включая YFP или CFP, что позволит использовать альтернативную флуоресцентную маркировку в других флуоресцентных длинах волн. Эти флуоресцентные репортерные гены могут быть использованы с системами Tet-On или Cre-ERT2.

Теломеразная обратная транскриптаза (TERT) является ограничивающим скорость компонентом голофермента теломеразы, который работает для расширения теломер после их укорочения во время деления клеток19,20. TERT был идентифицирован как маркер взрослых тканевых стволовых клеток в кишечнике21,22, костном мозге21, печени23, жировойкислоте 24, эндометрии25,26 и кости 1. Является ли экспрессия TERT в этих взрослых стволовых клетках исключительно для активности, расширяющей теломеразу, или для выполнения неканонических ролейTERT 27, до сих пор неизвестно. TERT-экспрессирующие покоя взрослые стволовые клетки (qASCs) были идентифицированы и прослежены по всему телу с трансгенной линией, отслеживающей мышей, для изучения мультипотентности и самообновляющейся способности этих стволовых клеток, а также их способности активировать, пролиферировать, дифференцировать и мигрировать 1,22,23,28. Создание трансгена Tert-rtTA было выполнено ранее1. В этой статье мы опишем использование линии трассировки линии мыши TERT для изучения TERT + qASCs, которую мы идентифицировали как новую популяцию ASC в мозге взрослой мыши.

Генерация линии мыши трансгенной трассировки линий
Чтобы создать линию мыши с трассировкой линий с помощью системы Tet-On, три трансгена должны быть объединены в одно животное посредством спаривания мыши. Первый — ртТА, экспрессируемый под контролем промотора интересующего гена (наш — TERT-rtTA). Таким образом, в клетке, которая экспрессирует этот интересующий ген, rtTA будет экспрессироваться. Вторым является ген oTet-Cre, который содержит элемент ответа тетрациклина (TRE), который позволит транскрипцию рекомбиназы Cre в присутствии как транскрипта слияния rtTA, так и тетрациклина или доксициклина. Тетрациклин или доксициклин можно вводить животному через питьевую воду или чау29. Наконец, должен быть ген, который будет активирован расщеплением cre recombinase. В этой рукописи геном маркировки, который мы опишем, является ген Rosa26-mTmG, который до рекомбинации Cre будет повсеместно транскрибировать mTomato (мембранная красная флуоресценция во всех клетках). Однако, если клетка экспрессирует транскрипт rtTA и содержит тетрациклин или доксициклин, рекомбинация Cre набора участков lox P между сайтами mTomato и mGFP изменит сайт R26 и заставит клетку продуцировать мембранный EGFP (mGFP или мембранную зеленую флуоресценцию) вместо мембранного томата. Неизгладимый характер этого сигнала mGFP позволит in vivo маркировать и отслеживать клетки по мере их пролиферации, миграции и дифференцировки. Следуя следу, клетки могут быть проанализированы на экспрессию GFP посредством иммунофлуоресценции в стандартных криосекциях или более толстых оптически очищенных мозгах.

В этой статье мы опишем использование конкретной линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Чтобы создать эту тройную трансгенную линию мышей, мы сначала спарили животных oTet-Cre (штамм The Jackson Lab #006234) с животными Rosa-mTmG (штамм The Jackson Lab #007676), чтобы создать двойных трансгенных мышей oTet-Cre::Rosa-mTmG. Эти животные были генотипированы с праймерами и шаблонами ПЦР, указанными в дополнительных таблицах 1 и 2. Мышей mTert-rtTA (созданных Дэвидом Бро1) спаривали с животными oTet-Cre::Rosa-mTmG для создания мышей mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG (рисунок 1A)1,30. Механизм действия линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG проиллюстрирован на рисунке 1B.

Конструкция индукции доксициклина и импульсной погони
При планировании экспериментов важно учитывать несколько факторов, которые будут влиять на исход экспериментов по отслеживанию родословной, в том числе возраст животного при индукции доксициклина, продолжительность введения доксициклина («импульсный» период), продолжительность времени после удаления доксициклина до сбора тканей («период погони») и сроки любых вмешательств во время этих процессов. Эти соображения дизайна исследования необходимы для понимания меченых клеток и их потомства в конце эксперимента. Первым шагом в процессе является определение возраста интереса животного и продолжительности введения доксициклина. Более длительные периоды импульса позволят большему количеству клеток экспрессировать промотор, связанный с rtTA, и большему количеству клеток, представляющих интерес, быть неизгладимо отмеченными. Тип клеток, который демонстрирует преходящую экспрессию интересующего гена, может потребовать более длительного импульсного периода, чем клетки, которые непрерывно экспрессируют интересующий ген. Однако, если целью исследования является понимание краткосрочных эффектов интересующей клетки или острого вмешательства, импульсный период не может быть слишком длинным, так как как только клетка отмечена, она будет прослежена через любое количество изменений в течение оставшейся части импульсного периода. В некоторых из наших исследований 2-дневный пульс без периода погони использовался для более точной имитации прямого репортера для TERT. Это связано с тем, что минимальная продолжительность времени для рекомбинации гена Rosa-mTmG составляет 2 дня31.

Следующим существенным периодом в эксперименте по погоне за пульсом является длина между удалением доксициклина и перфузией животного, также известная как «погоня». Период полувыведения доксициклина у мышей составляет примерно 170 минут независимо от пути введения, что позволяет сделать вывод о том, что индукция доксициклина, вероятно, больше не происходит через несколько часов после удаления32. Тем не менее, важно отметить, что метаболизм доксициклина медленнее у пожилых мышей, что может привести к более длительным эффективным «импульсным» периодам, чем у молодых животных33.

В течение периода погони меченые клетки будут по-прежнему маркироваться, даже после пролиферации, дифференцировки или миграции. Потомство этих клеток также будет помечено. Цель исследования будет определять длину парадигмы погони за пульсом. Если цель исследования состоит в том, чтобы понять регенерацию ткани в течение длительного периода времени с интересующими клетками, может потребоваться длительный период погони. Наконец, должны быть определены сроки любых вмешательств или лечения. Введение в течение импульсного периода будет влиять на клетки, экспрессирующие интересующий ген, а также на любое потомство, созданное в течение этого времени, тогда как введение в период погони может повлиять в основном на потомство интересующих клеток, хотя это будет зависеть от того, как быстро меченые клетки делятся или дифференцируются. Примеры экспериментальных конструкций с импульсным преследованием, которые мы использовали, описаны на рисунке 2А.

Также важно знать о возможности фонового сигнала GFP из-за протекающей экспрессии. Протекающая экспрессия возникает в результате присущего ей потенциала связывания между rtTA и последовательностями Otet в отсутствие доксициклина и остаточной активности трансгена Otet в отсутствие rtTA (рассмотрено в34). Протекающая экспрессия представляет собой одну из слабостей систем Тета, и хотя утечка часто является приемлемым недостатком системы, ситуации, когда протекающая экспрессия может привести к токсичности и смертности, например, при дифтерийном токсине (ДТА) у животных Otet-DTA, могут ограничить использование этих систем35.

Обработка мозга, сечение и иммунофлуоресценция тонких срезов для микроскопии
Чтобы проанализировать мозг мышей после эксперимента по отслеживанию родословной, мышей необходимо сначала перфузировать с помощью транскардиальной перфузии для удаления крови и ликвора, которые могут привести к высокой автофлуоресценции в мозге. Есть два широко используемых фиксатора, с помощью которых животное может быть перфузировано: Histochoice Tissue Fixative, глиоксальный фиксатор (GF) или 4% параформальдегид (PFA). Глиоксальные фиксаторы обеспечивают относительно мягкий процесс фиксации с меньшим количеством сшивок, чем PFA. Это уменьшает жесткость тканей, уменьшает потребность в извлечении антигена и позволяет использовать менее концентрированные растворы антител во время иммуноокрашивания. Однако, если они содержат метанол, это может служить для увеличения автофлуоресценции36. С другой стороны, PFA часто обеспечивает более надежную фиксацию, и хотя извлечение антигена потребуется во время иммуноокрашивания, существуют антитела, которые будут работать только с фиксированными тканями PFA, и перфузия с 4% PFA требуется для метода оптической очистки, описанного ниже.

Следующая перфузия является этапом пост-фиксации, на котором мозг погружается в тот же тип фиксатора, который используется во время перфузии в течение ночи. Это позволяет любым областям мозга, которые, возможно, не были полностью зафиксированы во время перфузии, продолжать фиксироваться. Затем мозг будет инкубирован в сахарозе в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), чтобы удалить как можно больше воды перед стадией замораживания, чтобы предотвратить образование льда в ткани («крио-сохранение»). Затем мозг может быть разрезан на любое количество сагиттальных, корональных или поперечных участков ткани для обработки. Как для точности, так и для воспроизводимости, калиброванные мозговые блоки должны использоваться таким образом, чтобы обеспечить последовательные порезы брегмы между животными. Наиболее важным фактором, который может повлиять на то, как разделен мозг, является область (области) мозга, представляющая интерес. Например, в то время как сагиттальный разрез может позволить анализировать больше областей мозга в одном участке ткани, этот разрез не позволит проанализировать нейро/глиогенные области желудочково-субвентрикулярной зоны (V-SVZ), поскольку боковые и медиальные стороны бокового желудочка будет невозможно различить в этом измерении и лучше наблюдать в корональной плоскости. Это может быть важным различием в исследованиях нейрогенеза взрослых, поскольку боковая сторона бокового желудочка содержит нейрогенный V-SVZ, в то время как медиальная стенка бокового желудочка является более глиогенной нишей37.

После того, как ткани были разделены на корональный, сагиттальный или поперечный срезы, они будут заморожены в блоки с использованием раствора для встраивания с оптимальной температурой охлаждения (OCT). Здесь мозг замораживается в этом встраиваемом материале с использованием смеси сухого льда и этанола. Если требуется анализ тонкого сечения, блоки будут нарезаны на криостате и, в зависимости от требуемого последующего анализа, могут быть прикреплены к положительно заряженным стеклянным слайдам в виде тонких срезов (<20 мкм). Стеклянные слайды, которые не заряжены, также могут быть использованы, но использование незаряженных слайдов может привести к тому, что ткани отклеятся от слайдов38. Если требуются свободно плавающие участки тканей средней толщины (>20 мкм), ткани будут собраны в виде свободно плавающих секций. Если требуются толстые срезы (0,5-4 мм), требуется нарезка незамороженных участков мозга вибратомом. Важно отметить различия в хранении между секциями на слайдах, которые требуют замораживания при -20 - -80 °C и свободно плавающими секциями, которые будут храниться при 4 °C.

Очистка мозга и цельная иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия
Если требуется более широкий, но менее подробный анализ клеток с прослеживаемой линией в мозге мыши, возможен комплексный анализ более толстых сегментов ткани мозга с очисткой мозга iDISCO39 с последующим иммуноокрашиванием и мозаичной конфокальной микроскопией z-стека или световой микроскопией. Здесь большие участки мозга мыши будут оптически очищены (процесс делипидации39), что лучше позволяет получать флуоресцентную визуализацию сигнала на участке ткани 1 мм. Недостатками этого процесса являются высокая автофлуоресценция и уменьшенная способность получать изображения морфологии клеток с высоким разрешением и подробный анализ совместного окрашивания из-за увеличения рабочих расстояний, требуемых по сравнению с более традиционными методами (тонкие криосекции или свободно плавающие участки). По этой причине мы рекомендуем очищать мозг для анализа крупномасштабных результатов отслеживания линий в нескольких областях мозга, вместо того, чтобы пытаться охарактеризовать или проанализировать отдельные клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Огайо.

1. Создание линии прослеживания линии мыши Тет-Он, стратегии размножения и генотипирования для экспериментальной когорты мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем создание мышиной системы Tet-On с Rosa-mTmG в качестве флуоресцентного репортерного гена, который подвергается рекомбинации Cre, однако различные другие рекомбинационные репортерные линии также могут быть использованы с системой Tet-On.

  1. Установите клетку для спаривания одного самца oTet-Cre (+/-) с одной или несколькими самками R26 (mTmG) (+/+). Обзор экспериментальной настройки сопряжения мыши см. на рисунке 1 .
  2. Результирующие щенки (F1) будут oTet-Cre (+/-) или oTet-Cre (-/-) и R26 (mTmG) (+/-). Выполняют генотипирование в соответствии с праймерами в Дополнительной таблице 1 и протоколами в Дополнительной таблице 2.
  3. При отъеме выполните тестирование зародышевой линии, принимая удар по уху от каждого отъема. Исследуйте ушной перфоратор под эпифлуоресцентным микроскопом в спектре GFP /FITC, чтобы определить, подверглось ли животное рекомбинации зародышевой линии в развитии. Если это так, животное будет экспрессировать GFP в каждой клетке, а ушной удар будет флуоресцировать сигналом mGFP. Эти животные не могут быть использованы для вязок или экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ушные клипсы мышей, которые не являются зародышевой линией, показывают только эндогенную флуоресценцию под микроскопом (рисунок 1C), в то время как животные зародышевой линии показывают яркий сигнал GFP (рисунок 1D). Контрольные уши могут быть у мышей, которые не содержат флуоресцентных трансгенов. Отметим, что волоски уха имеют высокую эндогенную флуоресценцию и не должны использоваться в качестве определяющего фактора (рисунок 1С). Кроме того, различия в эндогенной флуоресценции наблюдаются между мышами белого и черного цвета шерсти, и в этом анализе необходимо будет использовать контроль от мышей того же цвета шерсти, что и тестируемые мыши.
  4. Соедините одного самца oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) с одной или несколькими самками мышей oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG).
  5. Результирующее поколение (F2) составит 1/4 R26 (mTmG) (+/+) и 1/2 Cre (+/-). Скрестите этих животных с животными mTert-rtTA (+/+), спарив одно oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) с одним или несколькими животными mTert-rtTA (+/+).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали mTert-rtTA (+/+) животных, но этот процесс может быть выполнен с любой линией мыши rtTA30.
  6. Для экспериментальных животных настройте селекции на генерацию mTert-rtTA (+/+) или (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) или (+/-).

2. Индукция доксициклина Cre и импульсная конструкция

  1. Когда животные достигнут подходящего возраста для начала исследования, замените их питьевую воду водой докс: питьевой водой, содержащей 5% сахарозы и 2 мг / мл доксициклина гиклата. Используйте Cre-отрицательных животных, которые получают ту же погоню за пульсом доксициклина, что и экспериментальные животные, в качестве контрольной группы для результирующих флуоресцентных паттернов экспрессии.
    1. После приготовления храните воду докса при температуре 4 °C до 1 месяца. Дополнительные сведения см. в таблице 1 . Воду Dox можно вводить животным в питьевых бутылках в течение 5 дней, прежде чем она будет заменена, так как грибковый рост может произойти, если воду dox оставить при комнатной температуре в течение более длительных периодов времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для индукции сигнала mGFP при использовании трансгена mTmG требуется импульс доксициклина продолжительностью не менее 2 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не тестировали концентрации доксициклина, кроме 2 мг/мл. Предыдущая литература определила, что эта концентрация имеет самые высокие эффекты при введении через питьевую воду29. Количество доставляемого доксициклина может отличаться в зависимости от количества питья, сделанного каждым животным. Инъекция или прием доксициклина также могут быть сделаны для того, чтобы быть последовательными между животными40.
  2. После того, как период пульса закончится, удалите воду из клеток и замените ее обычной питьевой водой. Животные теперь будут находиться в периоде «погони» до самой смерти.

3. Транскардиальная перфузия и рассечение мозга

  1. Выньте мышь из клетки и удерживайте животное большим и указательным пальцами левой руки. Вводят животному через внутрибрюшинную (в..) инъекцию раствором 100 мг/мл кетамина и 20 мг/мл ксилазина в 0,9% стерильном физиологическом растворе для конечной концентрации 200 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина. Дополнительные сведения см. в таблице 1 .
    ВНИМАНИЕ: Протоколы анестезии могут отличаться в зависимости от страны. Кроме того, существуют эффекты анестетиков на мозг, включая изменения в морфологии и действии микроглии и уровнях кортикостерона, которые необходимо понимать при выполнении перфузий с целью сбора и анализа мозга41,42.
  2. Примерно через 1-2 мин животное потеряет свой корректирующий рефлекс. Чтобы проверить это, просто переверните животное на спину, и если оно не может откатиться на ноги, оно потеряло правильный рефлекс.
  3. Примерно через 5-10 минут животное потеряет педальный рефлекс. Чтобы проверить педальный рефлекс, используйте большой и указательный пальцы, чтобы ущипнуть каждую из ног животного. Если нет ответа, в виде прыжка или мышечного спазма, используйте ногти большого и указательного пальцев, чтобы ущипнуть каждую из ног животного. Если ответа нет, животное теряет педальный рефлекс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное реагирует на педальный рефлекс в течение более 15 мин после инъекции, может потребоваться дополнительная инъекция 1/2 первоначальной инъекции кетамина/ксилазина. Возраст, пол, генотип, фенотип и лечение могут повлиять на реакцию животного на этот лекарственный коктейль.
  4. После того, как корректирующие и педальные рефлексы будут потеряны, проверьте глазной рефлекс, слегка соприкоснувшись с глазным яблоком мыши пальцем в перчатке. Отсутствие реакции указывает на то, что глазной рефлекс был потерян.
  5. Закрепите мышь в положении лежа на спине лапами, прикрепленными к закрепляемой рабочей поверхности.
  6. Сделайте разрез через кожу хирургическими ножницами вдоль грудной средней линии примерно на 1-2 см ниже мечевидного отростка. Нарежьте выше до тех пор, пока не начнется мечевидный отросток.
  7. Обхватите хрящ мечевидного отростка щипцами. Вставьте ножницы и прорежьте мускулатуру и грудную клетку по диагонали вдоль правой стороны мыши до уровня ключиц.
    1. Поднимите грудную мускулатуру щипцами и прорежьте диафрагму, пока сердце не будет визуализировано. Затем сделайте идентичный диагональный разрез вдоль левой стороны мыши, убедившись, что предотвратите любой контакт с сердцем. Используйте гемостат, чтобы держать грудную мускулатуру подальше от полости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент мышь больше не сможет дышать, поэтому работайте быстро, чтобы предотвратить смерть до следующих шагов.
  8. Закрепите бьющееся сердце тупыми щипцами и вставьте дозирующую иглу в левый желудочек через основание дуги аорты.
  9. Зажмите основание иглы к левому желудочку чуть выше места введения.
  10. Сделайте разрез в правом предсердии и при первых признаках кровотока начните перфузию животного 20 мл 1x PBS при 8,11 мл/ мин.
  11. После того, как 1x PBS перфузирует тело, переключитесь на соответствующее фиксирующее средство для последующего применения и перфузируйте мышь 20 мл фиксатора.
    1. Для замороженного секционирования и иммуноокрашения перфузируйте животное глиоксальным фиксатором для очистки мозга, перфузируйте животное с 4% PFA в 1x PBS (рН 7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Признаки успешной перфузии включают жесткость животных (незначительная жесткость с глиоксалем, интенсивная жесткость с PFA) и отсутствие видимых кровеносных сосудов по всем тканям.
  12. Обезглавить мышь и удалить мозг, вставив ножницы в ствол мозга и разрезав вдоль сквамозного шва до лобно-подмышечного шва с каждой стороны. Затем нарежьте поперек фонтоназального шва, чтобы снять черепную крышку, стараясь не повредить обонятельную луковицу. Оттуда переверните череп вверх дном и используйте изогнутые щипцы, чтобы удалить мозг, обязательно перерезав зрительный нерв.
  13. Поместите перфузированный мозг в тканевый картридж и погрузите в фиксатор, используемый для перфузии животного на ночь при 4 °C.

4. Лечение мозга, нарезка и иммуноокрашивание мозга

  1. Лечение и нарезка мозга
    1. Извлеките мозговые картриджи из глиоксаль-фиксатора и инкубируйте в 15% сахарозы в 1x PBS в течение 2 дней при 4 °C или до тех пор, пока мозг не утонет.
    2. Удалите мозговые картриджи из 15% сахарозы и инкубируйте в 30% сахарозы в 1x PBS в течение 2 дней при 4 °C или до тех пор, пока мозг не утонет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации см. таблицу 1 .
    3. Удалите мозг из 30% сахарозы в 1x PBS и разделите мозг на различные «блоки», используя корональный блок мозга или сагиттальный блок мозга.
    4. Встраивание корональных или сагиттальных отделов мозга в соединение OCT путем размещения участков мозга на смеси сухого льда и этанола (EtOH). После того, как OCT побелеет и станет твердым, извлеките из сухого льда смесь EtOH и храните завернутую в парапленку, внутри герметичного мешка при -20 °C.
    5. Извлеките замороженные блоки из морозильной камеры и поместите внутрь криостат с внутренней температурой, установленной на -20 °C. Используйте OCT, чтобы прикрепить блок к металлическому патрону, чтобы ткань была прочно прикреплена. Дайте ~5 мин, чтобы ткань замерзла до патрона. Нарежьте ткань на 7 мкм, поместив каждый срез ткани на заряженный стеклянный слайд.
    6. Дайте слайдам выпекаться в течение ночи при 37 °C, а затем поместите при -20 °C до использования для иммуноокрашивания.
  2. Иммуноокрашивание
    1. Теплые горки до комнатной температуры (RT) и постфиксируются ледяным ацетоном в течение 15 мин.
    2. Промывайте слайды в течение 5 минут в 1x ополаскивательном буфере (например, IHC Select TBS Rinse Buffer), встряхивая при 60 об/мин при RT между каждым шагом.
    3. Пермеабилизируют для окрашивания ядерных антигенов 0,3% Тритоном Х-100 в течение 10 мин при РТ. Пермеабилизируют для окрашивания цитоплазматических антигенов 0,3% Tween-20 в течение 10 мин при РТ.
    4. Выполняйте извлечение антигена с помощью микроволнистых слайдов в 50-100 мл 1x DAKO Antigen Retrieval Solution на низком уровне в течение 10 мин, дважды. Затем промыть ополаскивателем в течение 5 мин при РТ.
    5. Инкубировать слайды в 0,3% Typogen Black в 70% EtOH в течение 20 мин при RT, а затем промыть ополаскивателем.
    6. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг каждой ткани, не давая тканям высохнуть. Затем блокируют в течение 20 минут при 37 °C с 1 каплей миллипорного блокирующего реагента на ткань. Затем добавляют 100 мкл первичного антитела, разведенного в разбавителе антител, к каждой ткани и инкубируют в течение ночи при 4 °C.
    7. На следующий день инкубируют участки во вторичных антителах Alexa Fluor в течение 10 мин при RT. Затем вымойте слайды в буфере для ополаскивания.
    8. Покрыть участки мозга в 100 мкл антитела 1:500 против GFP, конъюгированного с AlexaFluor 488 для усиления эндогенного сигнала GFP, отмечающего прослеживаемые клетки, и инкубировать в течение ночи при 4 °C.
    9. На следующий день промыть ополаскивателем 2 раза, а затем промыть в проточной DI воде в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно тщательно мойте водой DI, заботясь о том, чтобы избежать любой проточной воды на самих горках, которая может удалить участки мозга с горок.
    10. Противодействовать 100 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин. Затем промыть в проточной воде DI в течение 5 мин.
    11. Добавьте каплю монтажной среды поверх каждого участка ткани и запечатайте крышкой размером 22 мм x 22 мм. Визуализация рекомендуется в день монтажа для обеспечения оптимального сигнала.

5. Очистка мозга iDISCO (адаптировано из39)

  1. Фиксация и секционирование
    1. Постфиксируют мозг в 4% PFA на ночь при 4 °C, а затем снова в течение 1 ч при RT.
    2. Промывайте мозги в 1x PBS в течение часа, дважды, на RT. Затем разрезать на участки толщиной 1 мм с помощью необходимого мозгового блока и поместить в 5 мл микроцентрифужные трубки, содержащие 1x PBS.
  2. Предварительная обработка метанола (метанолом)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с возможностью влияния метанола на иммуноокрашание определенных белков, авторы хотели бы указать читателю на Renier et al. 2014 для протокола iDISCO без метанола альтернативы39. Дополнительные сведения о следующих решениях в этом разделе см. в таблице 1 .
    1. Промыть 1x PBS в течение 1 ч дважды (встряхивание) при RT.
    2. Промыть в 50% метаноле (в ПБС) в течение 1 ч (встряхивание) на РТ.
    3. Промыть в 80% метаноле в течение 1 ч (встряхивание) при РТ.
    4. Промыть в 100% метаноле в течение 1 ч дважды (встряхнуть) при РТ.
    5. Отбеливающие образцы с 5% перекисью водорода (H2O2) в 20% диметилсульфоксиде (DMSO)/метаноле (1 объем 30% H2O2/1 объем DMSO/4 объема метанола, ледяной холод) при 4 °C в течение ночи (встряхивание).
    6. После отбеливания промыть образцы метанолом в течение 1 ч дважды (встряхивание) на РТ.
    7. Промыть в 20% ДМСО/метанол в течение 1 ч дважды (встряхивание) при РТ.
    8. Промыть в 80% метаноле в течение 1 ч (встряхивание) при РТ.
    9. Промыть в 50% метаноле в течение 1 ч (встряхивание) на РТ.
    10. Промыть в ПБС в течение 1 ч дважды (встряхнуть) при РТ.
    11. Промывайте в PBS/0,2% Triton X-100 в течение 1 ч дважды (встряхивая) при RT.
  3. Иммуноокрашивание очищающего мозга
    1. Инкубируйте образцы в 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M глицина при 37 °C в течение ночи на орбитальном шейкере.
    2. Блокируйте в 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% козьей сыворотке при 37 °C в течение 3 дней на орбитальном шейкере.
    3. Промывайте образцы в 1x PBS/0,2% Tween-20/10 мкг/мл гепариновой натриевой соли из слизистой оболочки свиней в течение 1 ч дважды при 37 °C, а затем инкубируйте в 1x PBS/0,2% Tween-20/10 мкг/мл гепарина/5% DMSO/3% козьей сыворотки, содержащей 1:500 концентрацию анти-GFP кролика AlexaFluor 488 при 37 °C на орбитальном шейкере в течение 2 дней.
    4. Промывайте образцы в 1x PBS/0,2% Tween-20 с 10 мкг/мл гепарина в течение 1 ч при 37 °C на орбитальном шейкере, три раза, а затем один раз в сутки в течение 2 дней.
    5. Инкубировать образцы в течение ночи в 10 мл 50% v/v тетрагидрофурана (THF)/H2Oв конической пробирке объемом 15 мл.
    6. Инкубировать пробы в течение 1 ч в 10 мл 80% ТГФ/Н2O.
    7. Инкубировать образцы дважды в течение 1 ч в 100% ТГФ.
    8. Сушат образцы стерильной салфеткой и инкубируют в дихлорметане до тех пор, пока они не опустятся на дно флакона (примерно 40 мин). Не инкубировать >60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно обращайтесь с дихлорметаном под вытяжным кожухом.
    9. Инкубировать образцы в 18 мл дибензилового эфира (ДБЭ) до очистки (>2 ч).
    10. Храните образцы в DBE на RT до тех пор, пока они не будут готовы к изображению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов важно как можно скорее получить образец после завершения очистки.

6. Визуализация окрашенных слайдов или очищенного мозга

  1. Чтобы получить изображение иммуноокрашенных участков мозга, проанализируйте слайды с помощью конфокальной микроскопии, где может быть подтверждена коэкспрессия нескольких антител. Мы используем микроскоп Leica Stellaris 5 с гибридными детекторами HyD S, но подойдет любой точечный сканирующий конфокальный микроскоп. Цели включают HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 и HC PL APO 63x/1.40.
    1. Настройте правильные лазерные линии и эмиссионные фильтры. Требуемые лазеры и соответствующие интенсивности лазеров зависят от используемых комбинаций микроскопа и флуорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем комбинацию диодных 405 нм и лазеров белого света для точной настройки спектров возбуждения и излучения для каждого флуорофора или групп флуорофоров, используемых для уменьшения и устранения перекрестных помех. Аналогичные результаты могут быть достигнуты с использованием традиционных комбинаций лазер /фильтр, но обратите пристальное внимание на канал пропускания. Выпуск за обрез можно определить, включив одну лазерную линию в сочетании с каждой из желаемых комбинаций эмиссионных фильтров, чтобы увидеть, на какие каналы воздействует каждый конкретный лазер. Например, если диодный лазер 405 нм производит видимую флуоресценцию в эмиссионном фильтре GFP, происходит кровотечение. Убедитесь, что несколько каналов визуализируются последовательно кадр за кадром, чтобы значительно уменьшить количество кровотечений.
    2. Для мозга Tet-On с репортером mTmG выберите DAPI (например, 405 нм, эм. 450 нм), GFP (например, 488 нм, эм. 509 нм), tdTomato (например, 555 нм, эм. 582 нм) и соответствующий фар-красный флуорофор, чтобы соответствовать флуорофору, используемому на вторичном антителе. Мы рекомендуем Alexa Fluor 647 (например, 651 нм, эм. 667 нм).
    3. Сначала установите настройки с мозгом Cre-control, окрашенным как GFP, так и флуоресцентным вторичным. Эти срезы мозга будут контролировать фоновую флуоресценцию от флуоресцентных антител и не будут показывать реальный сигнал GFP.
    4. Проанализируйте каждый участок мозга сверху вниз, слева направо, чтобы убедиться, что ни один сигнал не был пропущен в анализе. При визуализации одного и того же участка мозга при различных увеличениях рекомендуется сначала использовать более низкие увеличения, так как более высокое увеличение будет быстрее отбеливать сигнал mTomato.
  2. Чтобы получить изображение очищенного мозга, используйте перевернутый конфокальный микроскоп с автоматизированной сценой и автоматизированной функцией укладки плитки. Мы используем микроскоп Leica Stellaris 5. Поскольку образцы настолько толстые (>500 мкм), требуются большие рабочие расстояния, которые ограничивают увеличение, которое может быть эффективно достигнуто. Мы используем объектив HC PL APO 10x/0.40 CS2 для всех очищенных изображений мозга.
    1. Начните с того, что положите очищенный участок мозга на стеклянную нижнюю чашку и погрузитесь в дибензиловый эфир.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дибензиловый эфир коррозионно влияет на большинство объективов и большинство пластмасс. По этой причине любой внутренний пластик в стеклянной нижней посуде должен быть покрыт быстросохнущим силиконовым эластомером.
    2. Настройте правильные лазерные линии и эмиссионные фильтры. Для совместно окрашенных мозгов Tet-On с репортером mTmG выберите DAPI, GFP, tdTomato и соответствующий фар-красный флуорофор, чтобы соответствовать флуорофору, используемому на вторичном антителе. Установите нужное разрешение, рекомендуем не менее 1024 x 1024. Установите точечное отверстие на 1 а.е.
    3. Сначала установите интенсивность лазера и усиление детектора с помощью мозга Cre-control, окрашенного как GFP, так и флуоресцентным вторичным. Эти срезы мозга будут контролировать фоновую флуоресценцию от флуоресцентных антител и не будут показывать реальный сигнал GFP.
    4. После того, как интенсивность лазера и усиление детектора были оптимизированы, наметьте мозг для визуализации. Начните с определения местоположения всего периметра секции мозга, чтобы установить оси X и Y для получения изображения. Затем определите ось Z, установив фокусную точку примерно на глубину центра ткани, и используйте элементы управления Z-позиционированием, чтобы найти «самую высокую» точку ткани (наиболее положительное Z-значение). Сканируйте различные участки ткани, увеличивая максимальную высоту оси Z по мере необходимости.
      1. Повторите для «самой низкой» (наиболее отрицательной Z-величины) точки, необходимой для получения всей толщины ткани. Stellaris 5 имеет предел ± 250 мкм фокусной точки. Это ограничивает оптические участки толщиной 500 мкм по оси Z. 3D-область секции мозга теперь известна.
    5. Установите размер Z-шага на 6 мкм и начните получать изображение. Время приобретения зависит от нескольких факторов и может составлять от часов до суток в зависимости от желаемых параметров. Чтобы уменьшить время получения изображения, попробуйте уменьшить разрешение, увеличить скорость лазерного сканирования или увеличить размер шага.
    6. После того, как мозаичное изображение всего очищенного участка мозга было захвачено, проанализируйте по желанию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В то время как флуоресцентный сигнал, полученный от системы Tet-On с флуоресцентным репортером, будет варьироваться в зависимости от интересующего промотора и используемого флуорофора (флуорофоров), мы опишем, как результаты были проанализированы с животными mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Анализ мозга взрослых после погони за пульсом привел к образованию мембранных GFP-экспрессирующих клеток в различных анатомических нишах. Необходимо отметить разницу в интенсивности флуоресценции между различными типами клеток. Одной из переменных, касающихся интенсивности флуоресцентности, является размер клеточной мембраны. Например, хориоидные эпителиальные клетки (CCEC) в сосудистом сплетении имеют толстую клеточную мембрану и сильный флуоресцентный сигнал, который легко отличить от окружающих клеток (рисунок 4A, B). Однако другие меньшие и в настоящее время неидентифицированные типы клеток в строме сосудистого сплетения имели более слабый сигнал GFP (рисунок 4C). В мозжечке глиальные клетки Бергмана экспрессировали более высокие уровни mGFP, чем клетки корзины, и вариации экспрессии mGFP даже существовали между отдельными клетками корзины (рисунок 4D). Обонятельные аксоны сенсорных нейронов в клубочковом слое обонятельной луковицы также выражали высокие уровни mGFP (рисунок 4A, E). Чтобы обеспечить идентификацию всех клеток mGFP+, важно идентифицировать как яркие, так и тусклые клетки GFP+ во всем мозге животных mTmG. У животных mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG мы наблюдали низкую фоновую экспрессию mGFP в областях мозга, включая кору головного мозга (рисунок 4A). Интересно, что мозжечок и ствол мозга показали более низкую фоновую экспрессию mGFP таким образом (рисунок 4A).

Во время анализа мозговой ткани после следа линии будут выявлены различия в паттернах экспрессии mGFP и mTomato как в областях мозга, так и в типах клеток. Обонятельные аксоны сенсорных нейронов, которые заполняют клубочковый слой обонятельной луковицы, выражали высокие уровни мембранного томата по сравнению с большинством других областей мозга, даже когда те же нейроны являются mGFP +, что указывает на то, что некоторые клетки, по-видимому, теряют сигнал mTomato медленнее (рисунок 4D). Напротив, в сосудистом сплетении клетки mGFP+ экспрессировали низкий mTomato (рисунок 4B,C). В большинстве других областей мозга томатный сигнал распределяется равномерно между типами клеток, причем эндотелиальные клетки являются одними из единственных клеток, чей флуоресцентный сигнал был достаточно ярким, чтобы выделиться на красном флуоресцентном фоне (рисунок 4B). Активация экспрессии mGFP и расщепление mTomato из генома во время рекомбинации приводит к потере экспрессии mTomato, но флуорофоры mTomato, которые экспрессируются на мембране, сохраняются до тех пор, пока они не разрушатся. По этой причине клетки mGFP+ часто экспрессируют переменный сигнал mTomato, который будет зависеть от актуальности рекомбинации, типа клетки и размера клеточной мембраны. Поэтому важно анализировать клетки на основе экспрессии mGFP и не исключать их из анализа, если они экспрессируют как mGFP, так и mTomato.

Альтернативные репортеры также могут использоваться в сочетании с системой Tet-On. Рекомбинация cre может индуцировать экспрессию GFP или RFP в клетках, которые обычно не экспрессируют флуоресцентную метку у животных Rosa-GFP или Rosa-RFP. Здесь анализ GFP или RFP укажет на выражение интересующего промоутера, и никакой флуорофорный сигнал не будет удален, как у животных mTmG. Однофторофорные репортеры позволяют иммуноокрашивать больше флуоресцентных комбинаций антител, поскольку мембранный помидор у животных mTmG предотвращает окрашивание в красную длину волны.

Figure 1
Рисунок 1. Генерация линии мыши Tet-On. (A) Набросок схемы разведения для создания мышей mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG из отдельных линий мышей. (B) Схема системы Tet-On в линии мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (С-Д) Репрезентативные изображения ушных зажимов, полученные с помощью канала FITC эпифлуоресцентного микроскопа от мышей, не относящихся к зародышевой линии (C) и зародышевой линии (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Экспериментальные разработки с прослеживанием линии мышей Тет-Он. Иллюстрации возможных экспериментов с мышами Тет-Он от базальной пролиферации, миграции и дифференцировки (1) до лечения во время дукс-пульса без погони за регенерацией или переуравновешиванием (2), вмешательства во время пульса с возможностью визуализации долгосрочных эффектов (3). Короткий импульс в 2 дня без последующей погони даст представление о почти базальном состоянии клеток TERT+, поскольку у этих клеток будет мало времени для активации, пролиферации, миграции или дифференцировки (4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Очистка мозга от мозгов мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. (А) Сагиттальное сечение 1 мм срезов мозга после фиксации. (B) Отдельные участки мозга помещаются в трубки объемом 5 мл для очистки мозга iDISCO39. (C) Очищенные мозги помещают в стеклянные нижние тарелки и погружают в DBE для сопоставления показателей преломления во время получения изображения. (D) Захватите всю область мозга в виде серии Z-стеков, которые будут объединены вместе, чтобы сформировать одно всеобъемлющее 3D-изображение мозга. Затем это может быть Z-максимальная интенсивность, проецируемая для создания 2D-изображения из набора 3D-данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Отслеживание линии мозга взрослых mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG мыши после 3-недельного импульса и 11-дневной погони за доксициклином. (A) Очищенный участок мозга взрослой мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG с определенными областями сигнала mGFP, показанными вставками (N = 3 самца мышей). (Б-С) Репрезентативное изображение mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG сосудистого сплетения, идентифицирующего mGFP+ CPECs (B) и меньшие, более слабые типы клеток mGFP+ (C; N = 4 самца, N = 6 самок). (D) Репрезентативное изображение mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG мозжечковой глии Бергмана (яркой) и корзинчатых клеток в молекулярном слое мозжечка (тусклого; N = 4 самца, N = 6 самок). (E) Репрезентативное изображение обонятельного клубочкового слоя мозга mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Пунктирные линии указывают на клубочковые отсеки (N = 4 самца, N = 6 самок). Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описан метод создания, использования и анализа тройной трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, отмечающую стволовые клетки в мозге взрослой мыши in vivo. В сочетании с иммуноокрашиванием или очисткой мозга может быть выполнена идентификация и характеристика прослеживаемых флуоресцентных клеток по всему мозгу. Этот метод предлагает возможность понять пластический / регенеративный / ремоделирующий потенциал меченых стволовых клеток, когда они активируют, мигрируют, дифференцируются или размножаются. В то время как предыдущие данные, полученные путем удержания меток тимидином-Н3 и BrdU, пришли к выводу, что V-SVZ, обонятельная луковица и подгранулярная зона зубчатой извилины были единственными нейрогенными областями мозга у взрослых млекопитающих 2,3,4,5,6,7,8,43, теперь понятно, что взрослый нейрогенез также происходит в коре44, гипоталамус45,46 и полосатое тело 47,48,49, а также потенциально другие новые ниши, которые не были хорошо изучены. Взрослый глиогенез, процесс, посредством которого глиальные клетки-предшественники создают новорожденные астроциты и олигодендроциты, происходит по всему мозгу, а также37, а глия и нейроны, как предполагается, происходят из одной и той же мультипотентной стволовой клетки. По этим причинам исследования по отслеживанию родословной были неотъемлемой частью понимания роли различных типов стволовых клеток, которые способствуют пополнению и регенерации нейронов и глии в мозге взрослых млекопитающих (рассмотрено в50).

Для исследований пластичности мозга взрослых оптимальным возрастом является возраст 12 недель, когда мышиный мозг завершил развитие51. При планировании длины пульса доксициклина и последующей погони понимание интересующего процесса имеет решающее значение, так что время погони за пульсом достаточно долгое, чтобы можно было произойти интересующие процессы. Например, создание новорожденных нейронов в обонятельной луковице из взрослых нервных стволовых клеток (ANSC) в V-SVZ составляет примерно 4 недели, как определено предыдущими исследованиями прослеживания линии52. Таким образом, исследование погони за импульсами, которое будет маркировать ANSC в V-SVZ, должно быть в течение этого периода времени, чтобы позволить ANSC в V-SVZ делиться, чтобы эти ANSC дифференцировались в промежуточные типы клеток, а эти промежуточные типы клеток мигрировали в обонятельную луковицу и дифференцировались во взрослые нейроны. Продолжительность погони будет определять количество времени, в течение которого меченые клетки и их потомство должны продолжать свою миграцию и дифференцировку, хотя эти процессы будут происходить и во время пульса. В совокупности важно понимать вовлеченные процессы, поскольку временная шкала каждого эксперимента по отслеживанию линий должна позволять происходить надлежащим процессам.

Хотя в этой рукописи подробно описывается система Тет-Он, существуют и другие трансгены трассировки линий, которые могут быть использованы. Трансген CreERT2 допускает экспрессию рекомбиназы Cre, которая активна только в присутствии тамоксифена или 4-OHT, производного тамоксифена. Когда этот Cre регулируется интересующим промоутером, введение 4-OHT или тамоксифена будет производить только рекомбинацию Cre в клетках, которые экспрессируют этот промотор. В сочетании с репортерным геном, таким как Rosa-LSL-GFP или Rosa-mTmG, рекомбинация Cre-lox будет неизгладимо маркировать клетки, которые экспрессируют Cre во время введения тамоксифена. Одним из недостатков этой системы является использование тамоксифена, который оказывает длительное неблагоприятное воздействие на нейрогенез как в пренатальном, так и во взрослом мозге17. По этой причине исследования трассировки линий с линиями CreERT2 должны будут учитывать соответствующие предостережения.

Исследования по отслеживанию линий во взрослом мозге часто проводятся с маркерами стволовых клеток, таких как Nestin, или маркерами глиальных клеток-предшественников, включая NG253,54. В то время как полученные данные указывают на оборот и дифференцировку этих клеток в новорожденные зрелые типы клеток, экспрессия этих маркеров различными другими типами клеток во взрослом мозге может быть запутанной. Например, Nestin, промежуточный белок нити, участвующий в митозе55, также экспрессируется зрелыми нейронами56 и типами менингеальных клеток57. Другие маркеры стволовых клеток включают глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)58,59 и транспортер аспартата глутамата 1 (GLAST)60, которые экспрессируются астроцитами по всему взрослому мозгу, а также61. По этой причине необходимы исследования отслеживания родословной с дополнительными маркерами. По мере того, как мы узнаем больше о широком влиянии взрослой пластичности на мозг, характеристика и анализ клеток, которые играют роль в этих процессах, и их потомство остаются жизненно важными для нашего понимания нейрогенных и глиогенных путей, участвующих в нейродегенеративном здоровье и многом другом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Диану Карлоне (Бостонская детская больница, Гарвардская медицинская школа) и д-ра Мэтью Лайнса (Центр диабета Джослина; Научно-исследовательский институт Медицинского центра штата Мэн) для руководства с использованием животных mTert-rtTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
  3. Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
  4. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
  5. Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
  6. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  7. Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
  8. Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
  9. Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
  10. Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
  11. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  12. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  13. Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G. Measurements of astrocyte proliferation. Methods in Molecular Biology. 758, 349-359 (2011).
  14. Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
  15. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  16. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
  17. Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
  18. Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
  19. Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
  20. Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
  21. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  22. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
  23. Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
  24. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
  25. Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
  26. Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
  27. Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
  28. Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
  29. Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
  30. Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
  31. Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  32. Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
  33. Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
  34. Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
  35. Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
  36. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
  37. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  38. Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 67-73 (2010).
  39. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  40. Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
  41. Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
  42. Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
  43. Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
  44. Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
  45. Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
  46. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
  47. Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G. Calretinin-immunoreactive neurons in the human striatum. Brain Research. 674 (2), 347-351 (1995).
  48. Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
  49. Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
  50. Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -, Lopez-Mascaraque, L. - Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
  51. Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
  52. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
  53. Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
  54. Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
  55. Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  56. Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
  57. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
  58. Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  59. Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
  60. DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
  61. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).

Tags

Неврология выпуск 183
Прослеживание линии индуцируемых флуоресцентно меченых стволовых клеток в мозге взрослой мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, G. S., Willows, J. W.,… More

Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter