Une approche photodynamique pour étudier la fonction de rupture des vésicules intracellulaires

Les endosomes, un type de vésicule intracellulaire (IV), sont formés par endocytose et mûrissent ensuite en lysosomes. Diverses voies de signal intracellulaires sont impliquées dans la formation des IV; De plus, différents stimuli intrinsèques et extrinsèques peuvent endommager les IV (p. ex., les agents pathogènes peuvent s’échapper de la membrane limitée pendant l’infection et entrer dans le cytoplasme¹). Cela s’accompagne généralement de la rupture des vésicules endocytotiques². Par conséquent, les techniques de ciblage et d’endommagement des IV peuvent être utilisées dans des études connexes³.

La thérapie photodynamique (PDT) est une thérapie dépendante de la lumière pour lutter contre les maladies en tuant les tumeurs ou les agents pathogènes⁴. Dans la PDT, les cellules ciblées sont marquées avec des chromophores non toxiques, appelés photosensibilisants, qui peuvent être activés localement par l’éclairage lumineux ^5,6. Les photosensibilisateurs absorbent l’énergie de la lumière et se transforment en un état singulet excité, conduisant à l’état triplet excité à longue durée de vie. Les photosensibilisateurs de l’état triplet peuvent subir un transfert d’électrons ou d’énergie et former des espèces réactives de l’oxygène (ROS) en présence d’oxygène, et peuvent détruire spatialement les cellules marquées dans la région d’illumination⁷. La conséquence varie en fonction de la puissance de la lumière⁸. En contrôlant la concentration de photosensibilisateurs et l’intensité de l’éclairage lumineux, les biomolécules ciblées peuvent être sélectivement inactivées sans lyse cellulaire, appelée inactivation de la lumière assistée par chromophore (CALI)⁹. Avec le développement significatif de photosensibilisateurs capables de marquer sélectivement diverses cibles subcellulaires, CALI est devenu un outil précieux pour contrôler l’inactivation médiée par la lumière des biomolécules pour les petites biomolécules telles que les nucléotides et les protéines, ainsi que les organites tels que les mitochondries et les endo-lysosomes 3,10,11,12,13.

Par rapport à CALI, des méthodes chimiques ou physiques sont également utilisées pour altérer les membranes, telles que la toxine bactérienne ^14,15 et le traitement Leu-Leu-OMe¹⁶ pour les lésions lysosomales. Cependant, ces méthodes présentent une altération massive des IV dans les cellules. Des photosensibilisateurs robustes (c.-à-d. l’acide disulfonique de chlorure de phtalocyanine Al(III) (AlPcS_2a)) sont utilisés dans le CALI; AlPcS_2a, ciblant les lysosomes par endocytose, est utilisé pour rompre des endosomes ou des lysosomes dans une région contrôlée¹⁷. AlPcS_2a est un chromophore à base de phtalocyanine imperméable à la membrane cellulaire qui se lie aux lipides sur la membrane plasmique et est internalisé par endocytose et finit par s’accumuler dans le lysosome par la voie endocytaire¹⁸. Il absorbe la lumière dans une région spectrale proche infrarouge et génère de l’oxygène singulet, un ROS majeur généré par AlPcS_2a¹⁸ excité. La désintégration de l’oxygène singulet limite rapidement sa diffusion et sa distance de réaction dans une minuscule région dans les cellules (environ 10-20 nm)¹⁹. En ajustant la durée d’incubation d’AlPcS_2a et l’éclairage lumineux, le contrôle spatio-temporel des dommages des IV dans une zone subcellulaire est autorisé. CALI devient donc un outil puissant pour examiner les conséquences des dommages intraveineux, ainsi que la formation et la régulation des intraveineuses.

Dans cette étude, un protocole spécifique de CALI utilisant AlPcS_2a comme photosensibilisateur est abordé. Ce protocole peut être appliqué à divers types d’intraveineuses, y compris les endosomes et les lysosomes, et utilisé pour examiner les réponses de suivi après la rupture de la membrane. Des cellules HeLa exprimant la galectine-3 conjuguée fluorophore-3^16,20 révélée après rupture du lysosome sont utilisées pour démontrer ce protocole.