הכנת עצב סיאטי חולדה לנוירופיזיולוגיה Ex Vivo

ההבנה הנוכחית של תפקוד עצבי בסיסי כפי שהיא מעוצבת בסיליקו חסרה במספר היבטים, בעיקר ביחס להשפעות של מידור רקמת העצב מחוץ לסומה, אקסון ודנדריטים. אינטראקציות אקסון-מיאלין עדיין אינן מובנות היטב, כפי שמעידה העובדה שאפילו מודלים מפורטים של עצבים חישוביים כגון MRG¹ (עבור עצבי יונקים) הלוכדים כראוי את תגובת הגירוי החשמלי הקונבנציונלית, אינם לוכדים התנהגויות אחרות שנצפו בניסוי כגון הובלת בלוק בתדר גבוה² או תגובת התפרצות משנית³.

פרוטוקול זה מספק שיטה לחקור ביעילות תהליכים נוירופיזיולוגיים ברמת העצב במודל של חיית מעבדה קטנה חריפה, תוך שימוש בפרוטוקול הכנה סטנדרטי כדי לבודד את העצב, לשלוט בסביבתו ולהסיר אותו מהקשר in vivo להקשר ex vivo. זה ימנע תהליכים אחרים בגוף או חומרי הרדמה המשמשים פרוטוקולי גירוי עצבי in vivo כדי לשנות את התנהגות העצבים ולבלבל את התוצאות הנמדדות או את^{הפרשנות} שלהם ^4,5. זה מאפשר פיתוח של מודלים מציאותיים יותר המתמקדים אך ורק בהשפעות ספציפיות לרקמות עצב שאינן מובנות היטב. פרוטוקול זה שימושי גם כנקודת בדיקה לגירוי עצבי חדש ולרישום חומרים וגיאומטריות של אלקטרודות, כמו גם כפרדיגמות גירוי חדשות כגון בלוק ^2,3 בתדר גבוה. וריאציות של טכניקה זו שימשו בעבר כדי לחקור פיזיולוגיה של העצבים בתנאים מבוקרים היטב⁶, למשל, כדי למדוד דינמיקה ותכונות של תעלת יונים או את ההשפעות של הרדמה מקומית⁷.

טכניקה זו מספקת מספר יתרונות בהשוואה לחלופות כגון ניסויים חריפים בבעלי חיים קטנים in vivo ⁸. הטכניקה מייתרת את הצורך לשמור על עומק ההרדמה כאשר הרקמה הוצאה מהגוף, ומפחיתה את כמות הציוד הנדרש כגון מפזר הרדמה, רכז חמצן וכרית חימום. זה מפשט את פרוטוקול הניסוי, מקטין את הסיכון לטעויות. מכיוון שחומרי הרדמה יכולים לשנות את תפקוד העצב⁴, טכניקה זו מבטיחה כי האמצעים לא יתבלבלו על ידי תופעות לוואי מתרכובות הרדמה אלה. לבסוף, טכניקה זו מתאימה יותר מניסויי in vivo חריפים כאשר חוקרים את ההשפעות של תרכובות נוירוטוקסיות כגון טטרודוטוקסין, אשר יהרגו חיה מורדמת על ידי שיתוק.

חתכי עצבים היקפיים הם מערכת ex vivo ייחודית שכן קיים סיכוי גבוה שהסיבים האחראים לאותות עצביים מוקלטים אינם מכילים כל סומה. כפי שבדרך כלל אלה היו ממוקמים, עבור נוירונים מוטוריים, בעמוד השדרה, ועבור נוירונים חושיים בגרעיני השורש הגבי שליד עמוד השדרה, ניתן לדגום באופן גס את הכנת קטע של עצב היונקים כאוסף של ממברנות צינוריות עם תעלות יונים, הפתוחות בשני^{הקצוות 9}. חילוף החומרים נשמר על ידי המיטוכונדריה הממוקמת באקסון בזמן כריתת רקמות¹⁰. תפירה של הקצוות הפתוחים של האקסולמה מעודדת לאחר המיצוי לסגור אותם ובכך לסייע בשמירה על שיפועים יוניים קיימים על פני הממברנה, החיוניים לתפקוד עצבי תקין.

כדי לשמור על הומאוסטזיס של רקמות מחוץ לגוף, מספר משתנים סביבתיים חייבים להיות מבוקרים היטב. אלה הם טמפרטורה¹¹, חמצון¹², אוסמולריות, pH^13,14, וגישה לגלוקוז כדי לשמור על חילוף החומרים. עבור פרוטוקול זה, הגישה היא להשתמש במאגר Krebs-Henseleit^15,16 (mKHB) שונה ברציפות עם תערובת של חמצן ופחמן דו חמצני. ה-mKHB נמצא במשפחת המאגרים הקרדיופלגיים ^6,17 המשמשים לשימור רקמות שנותחו מחוץ לגוף, למשל, בניסויי ex vivo. מאגרים אלה אינם מכילים המוגלובין, אנטיביוטיקה או אנטי פטרייתיים, ולכן הם מתאימים רק לתכשירים הכוללים כמויות קטנות של רקמות לזמן מוגבל. בקרת ה-pH הושגה עם זוג החמצונים הפחמיים והפחמן הדו-חמצני, מה שדרש אוורור מתמיד של החיץ עם פחמן דו-חמצני כדי לשמור על שיווי משקל ה-pH. זאת כדי להימנע משימוש בחומרי אגירה נפוצים אחרים כגון HEPES, אשר יכול לשנות את תפקוד תאי העצב¹⁸. כדי לחמצן את החיץ ולספק בקרת pH, נעשה שימוש בתערובת של 5% פחמן דו חמצני בחמצן הנקרא קרבוגן (95% O₂, 5% CO₂). מערבל חימום שימש לבקרת טמפרטורה של מיכל חיץ, והחוצץ הוחדר דרך אמבט עצבים, ולאחר מכן הוחזר למיכל ההתחלה. ניסוי טיפוסי יימשך 6-8 שעות לפני שהעצב מאבד את הכדאיות שלו וכבר לא מגיב מספיק לגירוי כדי שהאמצעים ייצגו רקמה בריאה.

כדי לייעל את יחס האות לרעש, אלקטרודות כסף-כלוריד שימשו להקלטה, אשר הוכנו על פי שיטות^{שתוארו קודם לכן 19}. לצורך גירוי, ניתן להשתמש בשילוב של אלקטרודות מסחריות של שרוול פלטינה מהמדף ואלקטרודות של חפתים פולימריים מוליכים בהתאמה אישית. אלקטרודות של חפתים פולימריים מוליכים הן בעלות יכולות מטען גבוהות במיוחד, אשר שימושיות בעת גירוי העצב באמצעות צורות גל משרעת גבוהות²⁰.

הממריץ המשמש בפרוטוקול זה תואר בעבר²⁰. תיעוד, קבצי עיצוב וסקריפטים של תוכנה לשימוש בהם זמינים לציבור²¹. ניתן להשתמש בממריצים אחרים כדי לבצע פרוטוקול זה; עם זאת, הממריץ המותאם אישית מסוגל גם לבלוק זרם חלופי בתדר גבוה (HFAC) ^2,20, המאפשר מגוון רחב יותר של ניסויים נוירופיזיולוגיים. כדי להשתמש בחסימת HFAC, מומלץ לאזיקים מוליכים של אלסטומר כדי למנוע נזק לעצב. אזיקי עצב אלסטומר מוליכים הם מערכי אלקטרודות רכים ופולימריים לחלוטין המופקים מאלסטומרים מוליכים כמרכיב המוליך ופולידימתילסילוקסן כבידוד²². המכשירים יוצרו בתצורה דו קוטבית תוך שימוש בטכניקות מיקרו-פבריקציה קונבנציונליות של לייזר.