Den nåværende forståelsen av grunnleggende nervefunksjon som modellert i silico mangler i flere aspekter, spesielt med hensyn til effekten av nervevevsdeling utenfor soma, axon og dendritter. Axon-myelin interaksjoner er fortsatt dårlig forstått som det fremgår av det faktum at selv detaljerte beregningsmessige nervemodeller som MRG¹ (for pattedyrnerver) som tilstrekkelig fanger konvensjonell elektrisk stimuleringsrespons, ikke fanger opp andre eksperimentelt observerte atferd som høyfrekvent blokkoverførsel² eller sekundær utbruddsrespons³.

Denne protokollen gir en metode for effektivt å undersøke nevrofysiologiske prosesser på nervenivå i en akutt liten laboratoriedyrmodell, ved hjelp av en standardisert forberedelsesprotokoll for å isolere nerven, kontrollere miljøet og fjerne den fra en in vivo-kontekst til en ex vivo-kontekst. Dette vil forhindre andre kroppsprosesser eller bedøvelse som brukes av in vivo nervestimulering protokoller for å endre nerveadferd og forvirre målte resultater eller deres tolkning ^4,5. Dette muliggjør utvikling av mer realistiske modeller som utelukkende fokuserer på effekter som er spesifikke for nervevev som er dårlig forstått. Denne protokollen er også nyttig som test for ny nervestimulering og registrering av elektrodematerialer og geometrier, samt nye stimuleringsparadigmer som høyfrekvent blokk ^2,3. Variasjoner av denne teknikken har tidligere blitt brukt til å studere nervefysiologi under tett kontrollerte forhold⁶, for eksempel for å måle ionkanaldynamikk og egenskaper eller effekten av lokalbedøvelse⁷.

Denne teknikken gir flere fordeler sammenlignet med alternativer som akutt in vivo liten dyreforsøk⁸. Teknikken hindrer behovet for å opprettholde anestesidybden ettersom vevet har blitt ekstrahert fra kroppen, og reduserer mengden nødvendig utstyr som en bedøvelsesdiffusor, oksygenkonsentrator og varmepute. Dette forenkler den eksperimentelle protokollen, noe som reduserer risikoen for feil. Siden bedøvelse kan potensielt endre nervefunksjonen⁴, sikrer denne teknikken at tiltak ikke blir forvirret av bivirkninger fra disse bedøvelsesforbindelsene. Til slutt er denne teknikken mer hensiktsmessig enn akutte in vivo-eksperimenter når du studerer effekten av nevrotoksiske forbindelser som tetrodotoxin, som ville drepe et bedøvet dyr ved lammelse.

Perifere nerveseksjoner er et unikt ex vivo-system siden det er stor sjanse for at fibrene som er ansvarlige for registrerte nevrale signaler ikke inneholder noen soma. Som disse normalt ville være plassert, for motoriske nevroner, i ryggraden, og for sensoriske nevroner i dorsalrot ganglia ved siden av ryggraden, kan forberedelsen av en del av pattedyrnerven grovt modelleres som en samling av rørformede membraner med ionkanaler, åpen i begge ender⁹. Metabolisme opprettholdes av mitokondriene som ligger i axonen på tidspunktet for vevs disseksjon¹⁰. Suturering av de åpne endene av axolemma oppfordres etter ekstraksjon for å lukke dem og dermed bidra til å opprettholde eksisterende ioniske gradienter over membranen, noe som er avgjørende for normal nervefunksjon.

For å opprettholde vev homeostase utenfor kroppen, må flere miljøvariabler kontrolleres tett. Disse er temperatur¹¹, oksygenering¹², osmolaritet, pH^13,14, og tilgang til glukose for å opprettholde metabolisme. For denne protokollen er tilnærmingen å bruke en modifisert Krebs-Henseleit buffer^15,16 (mKHB) kontinuerlig forverret med en blanding av oksygen og karbondioksid. mKHB er i familien av kardiolegiske buffere ^6,17 brukes til å bevare dissekert vev utenfor kroppen, for eksempel i ex vivo eksperimenter. Disse bufferne inneholder ikke hemoglobin, antibiotika eller antifungals og er derfor bare egnet for preparater som involverer små mengder vev i en begrenset periode. pH-kontroll ble oppnådd med karbonat- og karbondioksidredoksparet, som krever konstant lufting av bufferen med karbondioksid for å opprettholde pH-likevekt. Dette er for å unngå å bruke andre vanlige buffermidler som HEPES, som kan endre nervecellefunksjonen¹⁸. For å oksygenere bufferen og gi pH-kontroll ble det brukt en blanding av 5 % karbondioksid i oksygen kalt karbogen (95 % O₂, 5 % CO₂). En varmerører ble brukt til temperaturkontroll av en bufferbeholder, og bufferen ble perfundert gjennom et nervebad, og deretter resirkulert til startbeholderen. Et typisk eksperiment ville vare 6-8 timer før nerven mister sin levedyktighet og ikke lenger reagerer tilstrekkelig på stimulering for tiltak for å være representativ for sunt vev.

For å optimalisere signal-til-støy-forholdet ble sølvkloridelektroder brukt til opptak, som ble utarbeidet i henhold til tidligere beskrevne metoder¹⁹. For stimulering kan en kombinasjon av kommersielle off-the-shelf platina mansjettelektroder og skreddersydde ledende polymermansjettelektroder brukes. Ledende polymermansjettelektroder har spesielt høyere ladekapasitet, noe som er nyttig når du stimulerer nerven ved hjelp av høy amplitudebølgeformer²⁰.

Stimulatoren som brukes i denne protokollen, er tidligere beskrevet²⁰. Dokumentasjon, utformingsfiler og programvareskript som skal brukes, er offentlig tilgjengelig²¹. Andre stimulatorer kan brukes til å utføre denne protokollen. Imidlertid er den tilpassede stimulatoren også i stand til høyfrekvent alternativ strøm (HFAC) blokk ^2,20, noe som muliggjør et bredere spekter av nevrofysiologiske eksperimenter. For å bruke HFAC-blokk anbefales ledende elastomermansjetter for å unngå skade på nerven. Ledende elastomernervemansjetter er myke og fullt polymere elektrodekjeder produsert av ledende elastomerer som ledende komponent og polydimetylsiloksan som isolasjon²². Enheter ble produsert i en bipolar konfigurasjon ved hjelp av konvensjonelle lasermikrofabrikasjonsteknikker.