Omvänd genetik för att konstruera RNA-virusvarianter med positiv känsla

Framåtriktad genetisk screening börjar med en viral fenotyp av intresse och försöker sedan, genom att sekvensera dess genom och jämföra den med den ursprungliga stammens, identifiera den eller de mutationer som orsakar den fenotypen. I omvända genetiska screeningar introduceras däremot slumpmässiga mutationer i en målgen, följt av en undersökning av den resulterande fenotypen1^. För den omvända genetiken är mutagenes in vitro den mest använda tekniken för att skapa en pool av varianter som sedan screenas för fenotyper av intresse. Olika genetiska verktyg har rapporterats för att uppnå genomomfattande slumpmässig mutagenes av RNA-virus, inklusive felbenägen PCR (ep-PCR)^2,3, cirkulär polymerasförlängning⁴ och Mu-transposoninsättningsmutagenes 5,6,7. De två senare metoderna ger bibliotek med begränsad sekvensdiversitet och är benägna att introducera stora insättningar och raderingar, vilket är mycket dödligt för virus och allvarligt begränsar återhämtningen av infektiösa virusvarianter.

ep-PCR är en välkänd kraftfull mutagenesteknik som ofta används inom proteinteknik för att generera muterade enzymer för val av fenotyper med önskade egenskaper, såsom förbättrad termisk stabilitet, substratspecificitet och katalytisk aktivitet ^8,9,10. Denna teknik är lätt att utföra eftersom den kräver enkel utrustning, inte involverar tråkiga manipulationer, använder kommersiellt tillgängliga reagenser och är snabb; Dessutom genererar det bibliotek av hög kvalitet.

Här utvecklade vi en ny metod för fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS) för att generera kompletta genom av hepatit C-virus (HCV) genom att integrera ep-PCR, som inducerar slumpmässig genomomfattande substitutionsmutagenes och omvänd genetik. Till och med en enda nukleotidinsättning eller nukleotidradering är mycket skadlig för RNA-virus med positiv känsla ([+]ssRNA); därför är PCR-baserad substitutionsmutagenes den föredragna metoden för iterativ generering av stora, olika bibliotek av fullständiga (+)ss-RNA-virusgenom med god viabilitet.

FL-MRS är ett enkelt tillvägagångssätt som kan tillämpas på alla RNA-virus med positiv känsla med en genomlängd på ~10 kb genom genom den noggranna utformningen av en primeruppsättning som binder till den virala cDNA-klonen. pJFH1 är en infektiös cDNA-klon som kodar för HCV genotyp 2a och kan rekapitulera alla steg i virusets livscykel. Genom att använda FL-MRS-metoden demonstrerade vi syntesen av slumpmässigt mutagena helgenombibliotek (mutantbibliotek [MLs]) för att producera replikationskompetenta JFH1-varianter för vilka det inte fanns någon tidigare kunskap om de egenskaper som är associerade med mutationer. Vid exponering för ett antiviralt medel övervann några av virusvarianterna snabbt läkemedelstrycket med den önskade fenotypiska förändringen. Med hjälp av det protokoll som beskrivs här kan en uppsjö av virusvarianter genereras, vilket skapar möjligheter att studera evolutionen av (+)ssRNA-virus.