Protokollen beskriver en metode til at indføre kontrollerbar genetisk mangfoldighed i hepatitis C-virusgenomet ved at kombinere mutant RNA-syntese i fuld længde ved hjælp af fejlbehæftet PCR og omvendt genetik. Metoden giver en model for fænotypeselektion og kan bruges til 10 kb lange RNA-virusgenomer med positiv sans.
Manglen på en bekvem metode til iterativ generering af forskellige virale varianter i fuld længde har hindret undersøgelsen af rettet evolution i RNA-vira. Ved at integrere en fuld RNA-genomfejlbehæftet PCR og omvendt genetik kan tilfældig genom-dækkende substitutionsmutagenese induceres. Vi har udviklet en metode, der bruger denne teknik til at syntetisere forskellige biblioteker for at identificere virale mutanter med fænotyper af interesse. Denne metode, kaldet fuld længde mutant RNA-syntese (FL-MRS), giver følgende fordele: (i) evnen til at oprette et stort bibliotek via en meget effektiv et-trins fejlbehæftet PCR; ii) evnen til at skabe grupper af biblioteker med forskellige niveauer af genetisk mangfoldighed ved at manipulere troskaben af DNA-polymerase iii) oprettelse af et PCR-produkt i fuld længde, der direkte kan tjene som skabelon for mutant RNA-syntese og (iv) evnen til at skabe RNA, der kan leveres til værtsceller som en ikke-valgt inputpulje til screening for virale mutanter af den ønskede fænotype. Vi har ved hjælp af en omvendt genetisk tilgang fundet, at FL-MRS er et pålideligt værktøj til at studere viral-rettet evolution på alle stadier i livscyklussen for hepatitis C-virus, JFH1-isolat. Denne teknik ser ud til at være et uvurderligt værktøj til at anvende rettet evolution til at forstå tilpasning, replikation og rollen som virale gener i patogenese og antiviral resistens i RNA-vira med positiv sans.
Fremadrettet genetisk screening begynder med en viral fænotype af interesse og forsøger derefter ved at sekventere sit genom og sammenligne det med den oprindelige stamme at identificere mutationen (e), der forårsager fænotypen. I modsætning hertil introduceres tilfældige mutationer i et målgen i omvendt genetisk screening efterfulgt af en undersøgelse af den resulterende fænotype(r)1. For den omvendte genetiske tilgang er in vitro-mutagenese den mest anvendte teknik til at skabe en pulje af varianter, der efterfølgende screenes for fænotyper af interesse. Forskellige genetiske værktøjer er blevet rapporteret til opnåelse af genom-dækkende tilfældig mutagenese af RNA-vira, herunder fejlbehæftet PCR (ep-PCR)2,3, cirkulær polymeraseforlængelse4 og Mu-transposonindsættelsesmutagenese 5,6,7. De to sidstnævnte metoder giver biblioteker med begrænset sekvensdiversitet og er tilbøjelige til at indføre store indsættelser og sletninger, som er meget dødelige for vira og alvorligt begrænser genopretningen af infektiøse virale varianter.
ep-PCR er en velkendt kraftfuld mutageneseteknik, der i vid udstrækning anvendes inden for proteinteknologi til at generere mutante enzymer til udvælgelse af fænotyper med ønskede egenskaber, såsom forbedret termisk stabilitet, substratspecificitet og katalytisk aktivitet 8,9,10. Denne teknik er let at udføre, fordi den kræver simpelt udstyr, ikke involverer kedelige manipulationer, bruger kommercielt tilgængelige reagenser og er hurtig; Desuden genererer det biblioteker af høj kvalitet.
Her udviklede vi en ny metode til fuld længde mutant RNA-syntese (FL-MRS) til at generere komplette genomer af hepatitis C-virus (HCV) ved at integrere ep-PCR, som inducerer tilfældig genom-dækkende substitutionsmutagenese og omvendt genetik. Selv en enkelt nukleotidindsættelse eller deletion er meget skadelig for RNA-vira med positiv sans ([+]ssRNA); PCR-baseret substitutionsmutagenese er derfor den foretrukne metode til iterativ generering af store, forskelligartede biblioteker af fulde (+)ss RNA-virusgenomer med god levedygtighed.
FL-MRS er en ligetil tilgang, der kan anvendes på enhver RNA-virus med positiv sans med en ~ 10 kb genomlængde gennem det omhyggelige design af et primersæt, der binder til den virale cDNA-klon. pJFH1 er en infektiøs cDNA-klon, der koder for HCV-genotype 2a og kan rekapitulere alle trin i viruslivscyklussen. Ved at bruge FL-MRS-tilgangen demonstrerede vi syntesen af tilfældigt mutageniserede fuldgenombiblioteker (mutantbiblioteker [ML’er]) for at producere replikationskompetente JFH1-varianter, for hvilke der ikke var forudgående kendskab til egenskaberne forbundet med mutationer. Ved eksponering for et antiviralt middel overvandt nogle af de virale varianter hurtigt lægemiddeltrykket med den ønskede fænotypiske ændring. Ved hjælp af protokollen beskrevet her kan der genereres en overflod af virale varianter, hvilket skaber muligheder for at studere udviklingen af (+) ssRNA-vira.
I denne undersøgelse har vi beskrevet en enkel og hurtig FL-MRS-procedure, der integrerer ep-PCR18 og omvendt genetik til syntetisering af HCV-fuldgenombiblioteker, som derefter kan bruges i et cellekultursystem til at generere replikationskompetente varianter til screening af lægemiddelresistente fænotyper. Anvendelsen af Taq DNA-polymerase med lav nøjagtighed er en forudsætning for ep-PCR, der tillader inkorporering af substitutioner under PCR-amplifikation af et viralt genom i fuld længde…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringsstøtte (bevillingsnummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) til denne undersøgelse blev ydet af Department of Biotechnology, Indiens regering.
1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
Acetic acid | Merck | A6283 | |
Agarose | HiMedia | MB080 | |
Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
dATP Solution | NEB | N0440S | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
LB broth | HiMedia | M1245 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
Methanol | Merck | 106009 | |
Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
Pipette controller | Gilson | F110120 | |
Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
Skim milk | HiMedia | M530 | |
Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
Tris base | HiMedia | TC072 | |
Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
Water bath | GRANT | JBN-18 | |
Xba1 | NEB | R0145S |