Summary

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Published: April 06, 2022
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Summary

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

Abstract

La inmunidad hereditaria describe cómo algunos animales pueden transmitir el “recuerdo” de una infección previa a su descendencia. Esto puede aumentar la resistencia de los patógenos en su progenie y promover la supervivencia. Si bien se ha reportado inmunidad hereditaria en muchos invertebrados, los mecanismos subyacentes a este fenómeno epigenético son en gran parte desconocidos. La infección de Caenorhabditis elegans por el patógeno microsporidio natural Nematocida parisii da como resultado que los gusanos produzcan descendencia que es robustamente resistente a los microsporidios. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad intergeneracional en el modelo de infección simple y genéticamente tratable de N. parisii C. elegans . El artículo actual describe métodos para infectar a C. elegans y generar descendencia inmuno-preparada. También se proporcionan métodos para evaluar la resistencia a la infección por microsporidios mediante la tinción de microsporidios y la visualización de la infección por microscopía. En particular, la inmunidad hereditaria previene la invasión de células huésped por microsporidios, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se puede utilizar para cuantificar los eventos de invasión. La cantidad relativa de esporas de microsporidios producidas en la descendencia inmunoprimida se puede cuantificar tiñendo las esporas con un tinte de unión a la quitina. Hasta la fecha, estos métodos han arrojado luz sobre la cinética y la especificidad del patógeno de la inmunidad hereditaria, así como los mecanismos moleculares subyacentes a ella. Estas técnicas, junto con las amplias herramientas disponibles para la investigación de C. elegans, permitirán importantes descubrimientos en el campo de la inmunidad hereditaria.

Introduction

La inmunidad hereditaria es un fenómeno epigenético por el cual la exposición de los padres a patógenos puede permitir la producción de descendencia resistente a las infecciones. Este tipo de memoria inmune se ha demostrado en muchos invertebrados que carecen de sistemas inmunes adaptativos y pueden proteger contra enfermedades virales, bacterianas yfúngicas 1. Si bien la inmunidad hereditaria tiene implicaciones importantes para comprender tanto la salud como la evolución, los mecanismos moleculares subyacentes a esta protección son en gran parte desconocidos. Esto se debe en parte a que muchos de los animales en los que se ha descrito la inmunidad heredada no son organismos modelo establecidos para la investigación. Por el contrario, los estudios en el nematodo transparente Caenorhabditis elegans se benefician de un extenso conjunto de herramientas genéticas y bioquímicas 2,3, un genoma altamente anotado 4,5 y un corto tiempo de generación. De hecho, la investigación en C. elegans ha permitido avances fundamentales en los campos de la epigenética y la inmunidad innata 6,7, y ahora es un modelo establecido para estudiar la memoria inmune 8,9.

Los microsporidios son patógenos fúngicos que infectan a casi todos los animales y causan infecciones letales en humanos inmunocomprometidos10. La infección comienza cuando una espora de microsporidios inyecta o “dispara” su contenido celular (esporoplasma) en una célula huésped utilizando una estructura llamada tubo polar. La replicación intracelular del parásito da como resultado la formación de merontes, que finalmente se diferencian en esporas maduras que pueden salir de la célula11,12. Si bien estos parásitos son perjudiciales tanto para la salud humana como para la seguridad alimentaria, aún queda mucho por aprender sobre su biología de la infección12. Nematocida parisii es un parásito microsporidio natural que se replica exclusivamente en las células intestinales de los gusanos, lo que resulta en una fecundidad reducida y, en última instancia, la muerte. El modelo de infección por N. parisii C. elegans se ha utilizado para mostrar: (1) el papel de la autofagia en la eliminación de patógenos13, (2) cómo los microsporidios pueden salir de las células infectadas de forma no lítica14, (3) cómo los patógenos pueden propagarse de célula a célula mediante la formación de sincitia15, (4) las proteínas que N. parisii utiliza para interactuar con su huésped16, y (5) la regulación de la respuesta intracelular transcripcional del patógeno (IPR)17, 18.

Los protocolos para la infección de C. elegans se describen en el trabajo actual y se pueden utilizar para revelar la biología única de los microsporidios y diseccionar la respuesta del huésped a la infección. La microscopía de gusanos fijos teñidos con el tinte de unión a quitina Direct Yellow 96 (DY96) muestra la propagación de la infección de esporas de microsporidios que contienen quitina por todo el intestino. La tinción DY96 también permite la visualización de embriones de gusanos que contienen quitina para la evaluación simultánea de la gravedad del gusano (capacidad de producir embriones) como una lectura de la aptitud del huésped.

Trabajos recientes han revelado que C. elegans infectados con N. parisii producen descendencia que es robustamente resistente a la misma infección19. Esta inmunidad hereditaria dura una sola generación y depende de la dosis, ya que los hijos de padres más infectados son más resistentes a los microsporidios. Curiosamente, las crías preparadas con N. parisii también son más resistentes al patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, aunque no están protegidas contra el patógeno natural Virus Orsay19. El presente trabajo también muestra que la descendencia inmunoprimida limita la invasión de células huésped por microsporidios. El método también describe la colección de descendientes inmuno-cebados y cómo FISH se puede utilizar para detectar el ARN de N. parisii en las células intestinales para evaluar la invasión de la célula huésped y la activación de esporas20.

Juntos, estos protocolos proporcionan una base sólida para estudiar los microsporidios y la inmunidad hereditaria en C. elegans. Se espera que el trabajo futuro en este sistema modelo permita descubrimientos importantes en el campo naciente de la inmunidad heredada. También es probable que estas técnicas sean puntos de partida para investigar la inmunidad hereditaria inducida por microsporidios en otros organismos huéspedes.

Protocol

El presente estudio utiliza la cepa N2 de C. elegans Bristol de tipo silvestre cultivada a 21 °C. 1. Preparación de los medios de comunicación Preparar los medios M9 según el informe anterior21,22. Preparar el medio de crecimiento de nematodos (NGM) según el informe anterior21,22. Vierta 12 ml de NGM por placa de 6 cm o 30 ml p…

Representative Results

En el presente estudio, las poblaciones parentales de C. elegans (P0) se infectaron en la etapa L1 con una dosis baja de esporas de N. parisii . Estas condiciones de infección se utilizan típicamente para obtener un alto número de progenie F1 resistente a microsporidios a través del blanqueamiento de los padres. Las poblaciones parentales infectadas y los controles no infectados se fijaron en 72 hpi y se tiñeron con DY96 para visualizar los embriones de gusano y las esporas de microsporidios (<stro…

Discussion

El presente protocolo describe el estudio de los microsporidios y la inmunidad hereditaria en un modelo de infección por N. parisii C. elegans simple y genéticamente tratable.

La preparación de esporas es un protocolo intensivo que generalmente produce suficientes esporas para 6 meses de experimentos, dependiendo de la productividad24. Es importante destacar que se debe determinar la infectividad para cada nuevo “lote” de esporas antes de usarlo pa…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos agradecidos a Winnie Zhao y Yin Chen Wan por proporcionar comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención # 522691522691).

Materials

2.0 mm zirconia beads Biospec Products Inc. 11079124ZX
10 mL syringe Fisher Scientific 1482613
5 μm filter Millipore Sigma SLSV025LS
Axio Imager 2 Zeiss Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope Zeiss For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V Global Industrial T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers Fisher Scientific DRM600
Direct Yellow 96 Sigma-Aldrich S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI Biotium 23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI Biotium 23002
Fiji/ImageJ software ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor Thermo Sceintific 415110 / 1834090806873 Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe Biosearch Technologies Inc. Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2 Wild-type, Bristol strain Default strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N) Fisher Chemical FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%) Fisher Chemical SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope Zeiss For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379-100ML
Vectashield + A16 Biolynx VECTH1500

Referências

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Citar este artigo
Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection. J. Vis. Exp. (182), e63636, doi:10.3791/63636 (2022).

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