Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico

Esseri umani e batteri hanno coesistito per molto tempo. Hanno stabilito una relazione codipendente con effetti benefici reciproci che influenza le risposte immunitarie dell’ospite in modi quantitativi e qualitativi¹. Studi recenti suggeriscono un’associazione tra la composizione del microbiota intestinale e la patogenesi delle malattie autoimmuni che includono la sclerosi multipla 2, l’artrite reumatoide³, il diabete di tipo^{2 4}, la malattia infiammatoria intestinale⁵ e il lupus eritematoso sistemico (LES)⁶. Tuttavia, non è ancora chiaro se il microbiota intestinale sia la causa principale o un effetto secondario di queste malattie autoimmuni⁷. Potenzialmente, il microbiota intestinale potrebbe esacerbare la malattia durante la fase effettrice dei disturbi autoimmuni o svolgere un ruolo nella regolazione dell’induzione di queste malattie⁸.

La disbiosi intestinale è stata riportata in topi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) femminili inclini al lupus e sono stati osservati cambiamenti del microbiota intestinale con una significativa deplezione di lattobacilli⁹. Quando una miscela di cinque ceppi di Lactobacillus è stata somministrata per via orale, i sintomi simili al lupus sono stati ampiamente attenuati in questi topi, suggerendo un ruolo essenziale del microbiota nella regolazione della patogenesi del LES.

La seguente tecnica di estrazione del DNA consente di seguire le fluttuazioni del microbiota e analizzarle qualitativamente e quantitativamente durante il decorso della malattia murina simile al LES nei topi inclini al lupus. Sia che si tratti di esaminare il microbiota intestinale sano o di definire la disbiosi, è importante esaminare criticamente come vengono raccolti i dati e se sono accurati e riproducibili¹⁰. Ogni fase è fondamentale in questo processo. È necessario utilizzare una metodologia appropriata per estrarre il DNA microbico poiché qualsiasi possibile problema che introduce distorsioni durante il processo di estrazione del DNA potrebbe comportare una rappresentazione microbica imprecisa. Mentre il metodo fenolo-cloroformio è descritto qui, ci sono kit disponibili in commercio per estrarre il DNA da batteri che funzionano bene in casi particolari¹¹. Tuttavia, la loro usabilità è limitata dal costo e dalla quantità di campione richiesta.

Il protocollo qui presentato è conveniente e richiede solo una piccola quantità di campione. Funziona bene con qualsiasi tipo di campione di feci ed è utile nello studio delle dinamiche del microbiota intestinale nel tempo e nei confronti tra gruppi. Il DNA viene isolato con un metodo di purificazione dell’alcol, che utilizza fenolo, cloroformio e alcol isoamilico. L’estrazione a base alcolica aiuta a pulire e rimuovere il campione di proteine e lipidi, dove il DNA viene precipitato nella fase finale. Il metodo proposto ha un’efficienza e una qualità significativamente elevate e si è dimostrato accurato nell’identificazione delle popolazioni batteriche. Una nota critica durante la procedura è che può verificarsi una contaminazione del DNA e quindi è necessaria un’appropriata gestione del campione¹².

Il DNA viene quindi analizzato dalle piattaforme Next Generation Sequencing per il gene rRNA 16S, come l’Illumina MiSeq. In particolare, la regione iper-variabile V4 viene analizzata per fornire una migliore quantificazione per i taxa di alto rango¹³. La successiva analisi bioinformatica viene esternalizzata, seguita da un’analisi interna utilizzando metodi statistici standard. Esistono numerosi programmi software bioinformatici open source disponibili per il sequenziamento a valle e il tipo di analisi eseguite dipende fortemente dalla specifica questione biologica di interesse¹⁴. Questo protocollo si concentra specificamente sulle fasi sperimentali prima del sequenziamento e fornisce un metodo più versatile, economico, confrontabile ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali.