成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

1. TGTオリゴヌクレオチド調製物 注:オリゴヌクレオチドプローブ合成の詳細は、ここで概説されています。いくつかの変更と精製手順は、カスタム合成のために外部委託することができますのでご注意ください。 シクロ[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)]ペプチドの第1級アミンを、Zhangら22 によって記載されているように、1:1.5の比率(100:150nmoles)で10μLのジメチルホルムアミド中で混合することによって、アジド-NHSリンカーと共に活性化する。0.1 μLの有機塩基トリエチルアミンを加え、4°Cで12時間インキュベートする。 0.1M TEEA(溶媒A)および100%アセトニトリル(溶媒B)を用いて、流速1mL/分、初期条件を10%溶媒Bを用いて逆相HPLCにより生成物を精製し、0.5%/分の勾配で設定した。溶出したピーク(203nmにおける吸光度)を結合し、MALDI-TOF質量分析法によって検証する。生成物はcRGDfK-アジドである。 TGTトップストランドを生成するには、cRGDfK-アジドとアルキン-21-BHQ2オリゴヌクレオチド(TGTトップストランド:5Hexynyl/GTGAAATACCGCAGATGCG/3BHQ_2)を2:1の比率(͂200 μM:100 μM)で100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と5 mMのアスコルビン酸ナトリウムおよび0.1 μMの予め形成されたCu-THPTAと組み合わせます。反応を室温(RT)で最低4時間、または4°Cで一晩進行させる。 混合物をP2脱塩ゲルを通して処理し、過剰な染料、副生成物、有機溶媒、および未反応試薬を除去する。650 μL の予備水和 P2 ゲルで遠心分離カラムを 18,000 x g で 1 分間回転させて調製します。フロースルー液体を捨て、反応混合物を加える。再び18,000 x g で1分間スピンし、フロースルーを収集します。反応混合物を超純水で300μLの最終容量にする。注:P2ゲルを水で6時間予備水和します。 脱塩反応混合物を逆相HPLCにより精製する。この精製に使用される有機溶媒には、H2O中の0.1M TEAA(溶媒A)および100%MeCN(溶媒B、または移動相)が含まれる。 混合物を注入する前に、カラムを10%の初期条件と平衡化します 溶媒 B 1%/分の勾配で。流量を1mL/分に調整します。反応混合物を500μL注射針でHPLCループに注入する。 DNAの260 nmおよびBHQ2消光剤の560 nmでのピーク吸収を視覚化することによって生成物を収集します。溶出した生成物を真空遠心濃縮器で一晩乾燥させる。 Maらに記載されているように、TGTボトムストランドをCy3B−NHSエステルに結合するために求核置換を採用する。アル25。100 μM の 56 pN TGT ボトムストランド (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGTGCGGTATTTCACTTT) と、10 μL の DMSO に予め溶解した 50 μg の Cy3B-NHS エステルを混合します。この混合物のpHを0.1 M炭酸水素ナトリウムで9に調整し、1x PBSで最終容量を100 μLにします。反応混合物をRTで一晩インキュベートする。 P2ゲルろ過および逆相HPLCを使用して混合物を順次精製し、未反応の試薬、塩、および有機溶媒を分離します(ステップ1.4および1.5に記載)。 精製オリゴヌクレオチド-色素コンジュゲートの濃度は、分光光度計を用いて260nmにおける吸光度を記録することによって推定する。 精製物をMALDI-TOF質量分析法により特徴付ける。過剰の3-ヒドロキシピコリン酸をTA50溶媒(50:50 v/vアセトニトリルおよびddH2O中の0.1% TFA)に溶解し、新鮮なMALDIマトリックスを調製する。標識された生成物の推定および測定された分子量は、cRGDfK-1-BHQ2 – 8157.9(計算)、8160.1(見つかった)である。標識されたCy3Bは56pN TGT – 10272.7(計算)、10295.8(見つかった)。 上部ストランドと下部ストランドをヌクレアーゼフリーの水に別々に30~50μMの濃度で溶解します。ストックの汚染を避けるためにDNaseフリーのピペットチップを使用してください。短期用途は4 °C、長期用途は-20 °Cで保管してください。オリゴヌクレオチドの安定性は、繰り返し凍結融解サイクルの影響を受けない。 2. 表面処理 1日目: 25 mm のガラス製カバースリップ (最大 8 枚) をポリテトラフルオロエチレンラックに入れます。ラックを、40 mL の 200 プルーフエタノールを含む 50 mL ホウケイ酸ビーカーに入れます。ビーカーをパラフィンフィルムで覆い、水が入らないようにし、RTで10〜15分間35kHzの動作周波数で超音波処理します(図1A)。 パイレックスビーカーに硫酸と過酸化水素を3:1の比率で混合して調製したばかりのピラニア溶液40mLを50mLビーカーに充填する。ガラスピペットでかき混ぜる。カバースリップラックをビーカーに移し、ヒュームフードのRTで30分間インキュベートしてカバースリップ表面をエッチングします(図1B)。メモ: 白衣、手袋、ゴーグルなどの PPE をフル装備し、化学ヒュームフードで作業してください。過酸化水素を酸にゆっくりと加えて、溶液の過熱を防ぎます。 エッチング後、ピンセットを使用してカバースリップラックを超純水でビーカーに移します。このステップを15秒間隔で6回繰り返して、酸を完全に中和します(図1C)。注:ピラニア溶液は、酸廃棄物容器に捨てる前に、化学ヒュームフードに一晩放置してください。 カバースリップを目視で検査し、ガラス表面に模様やほこりの粒子がなく、表面がきれいに見えることを確認します。パターンまたはほこりが検出された場合は、手順2.1~2.4を繰り返します。メモ:処理したカバースリップを水に浸し、垂直に取り外して、表面の親水性をテストします。処理されたカバースリップ上の水は、パッチを形成する未処理のカバースリップと比較して、ヤングのリングを形成する均一なシートとして後退する。 カバースリップラックを200プルーフエタノールを入れたビーカーに移し、15秒間2回洗浄して表面を有機溶媒に平衡化させます。カバースリップラックをRTで1時間、3%APTESを含む200プルーフエタノール溶液に移し、カバースリップをシラン化します(図1D)。ビーカーをパラフィンフィルムで覆います。注:APTES堆積パラメータは、表面洗浄方法、溶媒含水率、APTES濃度、インキュベーション時間、およびアニーリングの温度によって異なります。 ラックを200プルーフエタノール溶液の入った清潔なビーカーに浸します。この洗浄を3回、それぞれ15秒間繰り返します(図1E)。 低い出口圧力で窒素(N2)ガスを使用してカバースリップを乾燥させます。カバースリップを10cmのポリスチレン皿に入れ、その中にパラフィンフィルムを平らに置きます。カバースリップが乾いていて、分離されていることを確認します(図1F)。 DMSO中の2mg/mL NHSビオチン溶液100μLをパラフィンフィルム上に置いた4つのカバースリップに加える。他の4つのカバースリップを上にして「サンドイッチ」をセットし(2つのカバースリップを間に機能化溶液を入れて互いに向いている)、皿を4°Cで一晩インキュベートします(図1G)。注:4°Cでは、NHS試薬はより安定しており、均一な表面官能化が容易になります。さらに、サンドイッチは試薬を保存します。サンドイッチに余分な溶液を加えると、サンドイッチが漏れてカバースリップが滑る可能性があるため、避けてください。 2日目: 4°Cから皿を取り出し、挟んだカバースリップを分離します。図 2A に示すように、コーティング面を互いに向くようにラック内のスリップを向けます。200プルーフエタノール溶液で3回、それぞれ15秒間洗浄します。N2ガスで乾燥させ、パラフィンフィルムを入れた新しい皿に入れます。メモ: カバースリップの向きを指示どおりにすると、機能化された表面を識別するのに役立ちます。 カバースリップを1mLの1x PBSで3回洗浄し、水相に平衡化します。各カバーグラスに1x PBS(w/v)中の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を800μL加え、RTで30分間インキュベートして表面を不動態化し、その後の機能化試薬の非特異的結合をブロックします(図2B)。 インキュベーション後、カバースリップを1mLの1x PBSで3回洗浄する。1 μg/mL のストレプトアビジンを 800 μL を RT で 1x PBS に 45 ~ 60 分間加え、カバーグラスを機能化します(図 2C)。メモ: パッシベーション効率を確認するために、ストレプトアビジンを含まないカバースリップを 1 つ保持します(オプション)。Add10nMビオチン化分子を実験条件に用いた画像。この表面強度は、カメラの暗いノイズに近いものにする必要があります。 ステップ2.11と同時に、サーモサイクラーを用いてPCRチューブ中で、1 M NaClの100 μL中に終濃度50 nMのTGTプローブ(上:下鎖、1:1のモル比で)を組み立てます。ストランドを95°Cで5分間解離させ、温度を25°Cまで下げて25分間維持することで徐々にアニールします(図2D)。TGTプローブの長時間の光への暴露を避けてください。 ストレプトアビジンインキュベーション後、1x PBSを使用してカバースリップを3回洗浄します。事前に組み立てられたTGTプローブを4つのカバースリップに100μL加え、残りの4つのカバースリップを使用して官能化側をプローブに向けてサンドイッチを作ります(8つの表面にはハイブリダイズTGTプローブの4本のチューブが必要です)。アルミホイルで覆い、RTで1時間インキュベートして、プローブを表面に結合させます(図2E)。 インキュベーション後、サンドイッチを分離し、カバースリップを1x PBSで3回洗浄します。これで、TGT サーフェスをイメージングする準備が整いました。カバースリップを洗浄済みのイメージングチャンバーに慎重に組み立て、1x PBSを追加して表面を水和させます(図2F)。メモ:チャンバーを締めすぎると、表面に亀裂が入ります。表面の乾燥を防ぎます。 3. 細胞調製と染色 上皮成長因子(EGF)刺激がCos-7のメカニズム、接着、および細胞拡散に及ぼす影響を調べるために、Cos-7細胞を0.05%トリプシン-EDTAで2分間トリプシン化した。HBSSで洗浄し、800 x g で5分間遠心分離することにより、トリプシンを中和する。中和工程をもう一度繰り返します。 ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に50 ng/mL EGFまたはEGFを含まないDMEMを添加した、組み立てられたTGT表面上の4 x 104 細胞の密度のプレート細胞。細胞培養インキュベーター内で5%CO2 を用いて37°Cで60分間細胞を拡散させる(図3A)。注:細胞は、成長因子からの刺激を避けるために血清を含まないDMEM中でインキュベートされる。EGFを10mM酢酸で希釈して1mg/mLのストックを作る。DMEMで50ng/mLでイメージング実験に使用します。 インキュベーション後、細胞を1x PBSで3回洗浄し、2mLの4%パラホルムアルデヒドでRTで12分間固定します(図3B)。注:すべてのインキュベーションステップは、溶液の均一な拡散のために〜35rpmのロータリーシェーカーで実行されます。TGT表面をイメージングの準備ができるまで覆って光から保護します。 固定液を吸引し、RTで5分間隔で1x PBSでカバースリップを5回洗浄します。オプションで、カバースリップを1x PBS中の50 mM NH4Clで37°Cで30分間インキュベートしてパラホルムアルデヒド関連の自己蛍光を消光し、1x PBSで5分間隔で3回洗浄します(図3B)。 バッファーA(1x PBS、5%正常ウマ血清、5%正常ヤギ血清、1%BSA、0.025%Triton X-100)を加え、37°Cで30分間インキュベートして細胞をブロックし透過除去します。1x PBSで5分間隔で3回洗浄します(図3B)。 カバースリップ付きのイメージングチャンバーを湿度容器に入れます。一次抗パキシリン抗体(局所接着マーカー)をブロッキングバッファー(1x PBS、5%正常ウマ血清、5%正常ヤギ血清、1%BSA、0.005%Triton x-100)中で1:250で希釈する。カバースリップあたり200 μLの一次抗体溶液とともに37°Cで2時間インキュベートします(図3B)。メモ: 表面を乾燥させないでください。 カバースリップを1x PBSで5分間隔で5回洗い、湿度容器に戻します。カバースリップあたり200μLのブロッキングバッファー中の1:800希釈で色素結合ヤギ抗ウサギ二次抗体および1:400希釈で色素結合ファロイジン(アクチン)の混合物と同時に細胞を標識する。37°Cで60分間インキュベートする(図3B)。 表面を1x PBSで5分間隔で5回洗浄し、イメージングの準備ができるまで4°Cで保管します(図3B)。メモ:信号の劣化を避けるために、表面処理から3日以内に画像サンプルを作成します。 4. 画像取得 488、561、および647 TIRF励起、RICM励起、完全焦点システム、およびデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡で、高い開口数(1.49)のオイル浸漬60倍対物レンズを使用します。 対物レンズにオイルを加え、サンプルチャンバーのカバースリップ底部を清掃し、サンプルをステージ上に置きます。細胞に集中し、完璧な焦点を当てます。 顕微鏡を落射蛍光励起と発光フィルターを除去したGFPフィルターキューブを備えたRICMイメージングモードにします。落射照明絞りを閉じてセンタリングして、RICMを合わせます。 顕微鏡をレーザー励起とクワッドパスTIRFフィルターキューブを備えたTIRFモードにします。488nmレーザーを部屋の天井の小さなスポットに焦点を合わせ、ライブモードでカメラの蛍光を監視しながら臨界角を過ぎるまで入射角を高くします。臨界角を超えたときの背景蛍光と単一の焦点面の急激な減少を観察します。注:TIRFは、サンプルカバースリップ界面に最も近い薄い領域(〜100nm)を励起し、細胞内からの焦点ずれ蛍光を排除しながら、開いたTGTプローブと焦点接着を強調します。TIRFが利用できない場合は、落射蛍光を使用することができる。ただし、信号対雑音比は低くなります。 RICMを使用してカメラの「ライブ」モードを使用してイメージングする細胞を同定します。 アクチン(640 nm ex)、インテグリン張力(561 nm ex)、およびパキシリン(488 nm ex)のRICM画像およびTIRF画像を取得します。200msの露光時間で順次画像を取得します。メモ:露出時間は、対物レンズ、レーザー出力、発光フィルタ、カメラ感度など、多くの要因に依存します。信号はバックグラウンドより少なくとも2倍大きくなければなりません。バックグラウンドは約 1000 AU なので、信号は少なくとも 2000 ~ 3000 AU である必要があります。 少なくとも30セルについて4.4-4.5を繰り返します。カバースリップを交換し、焦点を合わせ、4.4-4.5を繰り返します。 5. データ解析 注:フィジーソフトウェアを使用して定量的な画像分析を実行し、統計ソフトウェアを使用して分析を実行します。 1 つのセルのイメージ セットを開きます。 ImageJ フリーハンド選択ツールを使用して RICM 画像内のセルの境界をトレースして、セル領域のマスク(RICM マスク)を作成します。関心領域 (ROI) を ROI マネージャー (ROI マネージャー>>ツールの分析) に保存します (図 4A1,2)。 インテグリン張力画像内のセルの外側の代表領域を選択し、少なくとも200 x 200ピクセルのROIを描画します。他の細胞または蛍光破片をROIから除外します。測定ツール(分析>測定)を使用してROI内のバックグラウンド蛍光を測定します(図4A3)。 張力画像からステップ5.2で得られた平均バックグラウンド蛍光を減算(処理>数学>減算)する(図4A4)。 ステップ5.2で設定したRICMマスクを使用して、セルフットプリント内の張力信号を定義します(ROIマネージャ>マスク>編集>外側をクリア>選択)します(図4A5)。 Huangの自動しきい値設定方法(画像>>しきい値の調整)を使用して、張力画像のしきい値マスクを作成します(図4A6)。しきい値マスクが、生成されたインテグリン張力の領域を最もよく表していることを確認してください。経験則として、しきい値を平均バックグラウンド蛍光の 2 倍に設定します。 しきい値テンションマスクの選択を作成します(>選択の編集>作成)(図4A7)。 選択したマスクをステップ5.4で生成された張力画像に転送し、オープンプローブの積分強度を測定します(ROIマネージャ > 選択 (テンションマスク)> 分析 > 測定 > RawIntDen)(図4C)。 RICMマスク(ROIマネージャ > 選択 (RICMマスク)>マスク の適用 > 分析 >測定)からセルの形態測定特性領域、円形度、およびアスペクト比 を測定します(図4B)。 張力マスク画像を選択し、RICMマスク(ROIマネージャ>選択(RICMマスク)または分析>測定>%面積)を適用することにより、破裂プローブによるセルフットプリントのパーセントとして定義さ>る機械的破裂密度を測定します(図4C)。 さらなる分析と視覚化のために測定値を統計ソフトウェアにエクスポートします。 すべてのセルに対して 5.1 ~ 5.11 を繰り返します。