JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Spanningsmeter tether sondes voor het kwantificeren van groeifactor gemedieerde integrinemechanica en adhesie

Published: February 11, 2022
doi:
10.3791/63529
,
1Department of Cell, Developmental, and Integrative Biology,University of Alabama at Birmingham

Summary

TGT surface is een innovatief platform om groeifactor-integrine overspraak te bestuderen. Het flexibele sondeontwerp, de specificiteit van de adhesieligand en de nauwkeurige modulatie van de stimulatieomstandigheden maken robuuste kwantitatieve beoordelingen van het EGFR-integrine-samenspel mogelijk. De resultaten benadrukken EGFR als een ‘mechano-organizer’ tuning integrine mechanica, die de focale adhesieassemblage en celverspreiding beïnvloedt.

Abstract

Meercellige organismen vertrouwen op interacties tussen membraanreceptoren en verwante liganden in de omringende extracellulaire matrix (ECM) om meerdere functies te orkestreren, waaronder adhesie, proliferatie, migratie en differentiatie. Mechanische krachten kunnen vanuit de cel via de adhesiereceptorintegrine worden overgedragen op liganden in de ECU. De hoeveelheid en ruimtelijke organisatie van deze celgegenereerde krachten kan worden gemoduleerd door groeifactorreceptoren, waaronder epidermale groeifactorreceptor (EGFR). De tools die momenteel beschikbaar zijn om overspraak-gemedieerde veranderingen in de celmechanica te kwantificeren en deze te relateren aan focale verklevingen, cellulaire morfologie en signalering zijn beperkt. DNA-gebaseerde moleculaire krachtsensoren bekend als spanningsmeter tethers (TGT’s) zijn gebruikt om deze veranderingen te kwantificeren. TGT-sondes zijn uniek in hun vermogen om zowel de onderliggende krachtdrempel te moduleren als piconewtonschaalreceptorkrachten over het gehele aanhangende celoppervlak te rapporteren bij diffractie-beperkte ruimtelijke resolutie. De hier gebruikte TGT-sondes vertrouwen op de onomkeerbare dissociatie van een DNA-duplex door receptor-ligandkrachten die een fluorescerend signaal genereren. Dit maakt kwantificering van de cumulatieve integrinespanning (krachtgeschiedenis) van de cel mogelijk. Dit artikel beschrijft een protocol waarbij TGT’s worden gebruikt om de impact van EGFR op integrinemechanica en adhesievorming te bestuderen. De assemblage van het mechanische TGT-detectieplatform wordt systematisch gedetailleerd en de procedure voor beeldkrachten, focale verklevingen en celspreiding wordt beschreven. Over het algemeen maakt het vermogen om de onderliggende krachtdrempel van de sonde, de adhesieligand en het type en de concentratie van de groeifactor die wordt gebruikt voor stimulatie te moduleren, dit een robuust platform voor het bestuderen van het samenspel van diverse membraanreceptoren bij het reguleren van geïntegreerde gemedieerde krachten.

Introduction

Cellen hebben het intrinsieke vermogen om mechanische krachten te voelen, te genereren en erop te reageren, wat leidt tot veranderingen in cellulair fenotype en remodellering van de lokale micro-omgeving 1,2. Krachten spelen een cruciale rol bij het reguleren van vele aspecten van celgedrag, waaronder hechting, migratie, proliferatie, differentiatie en wondgenezing 3,4. Aberraties in de bidirectionele mechanische uitwisseling tussen een cel en de micro-omgeving kunnen leiden tot zieke toestanden, waaronder kanker5. Talrijke membraanreceptoren zijn betrokken bij het handhaven van celmatrixhomeostase; hiervan hebben integrinen en epidermale groeifactorreceptor (EGFR) een robuuste synergie 6,7. Klassiek leggen integrines de mechanische link tussen de micro-omgeving en intracellulair cytoskelet, terwijl EGFR celgroei, proliferatie en overleving reguleert 8,9. EGFR is een zeer bestudeerd therapeutisch doelwit, gericht op outside-in regulatie die intracellulaire signalering vergemakkelijkt. EGFR-integrine overspraak is genetisch en biochemisch vastgesteld om de progressie van meerdere ziekten te reguleren, waaronder kanker10,11. Hoewel studies wijzen op het bestaan van EGFR-integrine-samenspel, worden de uitkomsten toegeschreven aan signaalroutes weg van het plasmamembraan 7,12,13,14. De impact van EGFR, of andere groeifactoren, op de celmechanica blijft grotendeels onontgonnen, deels vanwege het gebrek aan hulpmiddelen om cellulaire krachten en signaalresultaten te meten. De uitdaging ligt in het identificeren van geschikte hulpmiddelen om de communicatie tussen deze parallelle signaleringsparadigma’s te bestuderen en hun specifieke bijdragen aan de celmechanica te kwantificeren.

Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om krachten te meten die worden gegenereerd door celadhesiereceptoren, en de lezer wordt verwezen naar diepgaande beoordelingen van deze technieken15,16. Kortom, tractiekrachtmicroscopie en micro-pijler arraydetectie vertrouwen op de vervorming van een onderliggend substraat om nanonewton (nN) krachten af te leiden, een orde van grootte meer dan individuele receptorkrachten17,18. Single-molecule technieken, waaronder AFM en optische pincet, zijn gevoelig voor single protein piconewton (pN) krachten, maar meten slechts één receptor tegelijk en bieden geen goede (of enige) ruimtelijke resolutie. DNA-gebaseerde moleculaire spanningsondes en spanningsmeter tether (TGT) sondes bieden pN-krachtresolutie met diffractie-beperkte (of betere) ruimtelijke resolutie, waardoor ze een unieke rol spelen bij het bestuderen van eencellige krachten19,20 uit verschillende celtypen, waaronder fibroblasten, kankercellen, bloedplaatjes en immuuncellen 21,22,23,24 . Terwijl moleculaire spanningsondes een uitschuifbaar “veer” -element hebben, ideaal voor real-time beeldvorming, scheuren TGT-sondes onomkeerbaar, waardoor een fluorescerende “krachtgeschiedenis” achterblijft. TGT’s moduleren bovendien de spanningsdrempel van het onderliggende substraat; een reeks sondes met vergelijkbare chemische samenstellingen maar verschillende breekkrachten, of spanningstoleranties (Ttol), kan worden gebruikt om de minimale spanning te kwantificeren die nodig is voor focale adhesievorming en celverspreiding. TGT-sondes bestaan uit twee complementaire DNA-strengen, een verankerd aan het oppervlak en de andere presenteert een ligand aan de cel. Als een receptor het ligand bindt en een kracht uitoefent die groter is dan deT-tol van de sonde, worden de strengen gescheiden. Ttol wordt gedefinieerd als de constante kracht die nodig is om 50% van de sondes te scheuren in een interval van 2 s onder ideale omstandigheden. Bij “turn-on” TGT-sondes kan een quencher op de bovenste streng worden gescheiden van een fluorofoor op de onderste streng. Alleen waar de TGT-sonde is gescheurd, vermoedelijk door krachten groter dan of gelijk aan Ttol, wordt een fluorescerend signaal gegenereerd. TGT-sondes kunnen ook worden bevestigd, waardoor eenvoudige manipulatie van biologische systemen en het testen van meerdere aandoeningen mogelijk is. Om deze redenen werden in dit werk TGT-sondes gebruikt.

TGT-sondes werden gebruikt om te bestuderen hoe integrine-afhankelijke celadhesie en mechanische krachten worden gemoduleerd door geactiveerde EGFR21. Dit werk vestigde EGFR als een ‘mechano-organisator’, die focale adhesieorganisatie en spanningsgeneratie afstemde. Bovendien bleek dat EFG-stimulatie de distributie en rijpheid van focale verklevingen en verbeterde celverspreiding beïnvloedde. Deze benadering kan in toekomstige studies worden gebruikt om te onderzoeken hoe groeifactoren mechanische krachten in tumorprogressie en -dynamiek beïnvloeden. Hoewel de rol van EGFR-integrine-overspraak bij het reguleren van de epitheliale naar mesenchymale overgang is vastgesteld, blijft de rol van mechanische krachten in dit proces onderbelicht10.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor deze experimenten met betrekking tot de synthese en assemblage van 56 pN TGT-sondes, het genereren van TGT-oppervlakken op glazen coverslips, toepassing van Cos-7-cellen op het TGT-oppervlak en stimulatie met EGF, fixatie en kleuring van cellen met falloidine, en een anti-paxilline-antilichaam, hoge resolutie totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) en reflectie-interferentiecontrastmicroscopie (RICM) beeldvorming, en beeldkwantificering. Dit protocol, hoewel geschreven om EGF-stimulatie van Cos-7-cellen te onderzoeken, is gemakkelijk aan te passen voor veel op TGT gebaseerde experimenten. Verschillende liganden,T-tol, celtypen, stimulatieparameters, eiwitten die na fixatie zijn gelabeld en kwantitatieve analyse kunnen eenvoudig worden vervangen, waardoor dit protocol robuust en op grote schaal bruikbaar is.

Protocol

1. TGT oligonucleotidepreparaat OPMERKING: De details van de synthese van oligonucleotidesondes worden hier beschreven. Houd er rekening mee dat sommige wijzigingen en zuiveringsstappen kunnen worden uitbesteed voor aangepaste synthese. Activeer het primaire amine van het cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] peptide met het azide-NHS linker zoals beschreven door Zhang et al22 door een 1:1,5 verhouding (100:150 nmol) te mengen in een eindvolume van 10 μL dimethylformamide. Voeg 0,1 μL van de organische basistriethylamine toe en incubeer gedurende 12 uur bij 4°C. Zuiver het product door omgekeerde fase HPLC met behulp van 0,1 M TEAA (oplosmiddel A) en 100% acetonitril (oplosmiddel B) met een debiet van 1 ml/ min en de beginconditie van 10% oplosmiddel B ingesteld op een gradiënt van 0,5% / min. Combineer de eluted pieken (absorptie bij 203 nm) en verifieer door MALDI-TOF massaspectrometrie. Het product is cRGDfK-azide. Om de TGT-topstreng te genereren, combineert u cRGDfK-azide en alkyne-21-BHQ2 oligonucleotide (TGT-topstreng: 5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2) in een verhouding van 2:1 ( ͂200 μM: 100 μM) in 100 μL 1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 5 mM natriumascorbaat en 0,1 μM voorgevormd Cu-THPTA. Laat de reactie minimaal 4 uur duren bij kamertemperatuur (RT) of een nacht bij 4 °C. Verwerk het mengsel door de P2-ontziltingsgel om overtollige kleurstof, bijproducten, organisch oplosmiddel en niet-gereageerde reagentia te verwijderen. Bereid de centrifugekolom met 650 μL voorgehydrateerde P2-gel door deze gedurende 1 minuut op 18.000 x g te draaien. Gooi de doorstroomvloeistof weg en voeg het reactiemengsel toe. Draai opnieuw op 18.000 x g gedurende 1 minuut en verzamel de doorstroom. Breng het reactiemengsel met ultrapuur water op een eindvolume van 300 μL.OPMERKING: Hydrateer de P2-gel gedurende 6 uur met water. Zuiver het ontzoute reactiemengsel door reverse-phase HPLC. De organische oplosmiddelen die voor deze zuivering worden gebruikt, omvatten 0,1 M TEAA in H2O (oplosmiddel A) en 100% MeCN (oplosmiddel B, of de mobiele fase). Voordat u het mengsel injecteert, moet u de kolom in evenwicht brengen met een begintoestand van 10% oplosmiddel B met een gradiënt van 1%/min. Stel het debiet in op 1 ml/min. Injecteer het reactiemengsel in de HPLC-lus met een injectienaald van 500 μL. Verzamel het product door de piekabsorptie te visualiseren bij 260 nm voor het DNA en 560 nm voor de BHQ2-quencher. Droog het geëlueerde product een nacht in een vacuüm centrifugale concentrator. Gebruik nucleofiele substitutie om TGT-bodemstreng te koppelen aan Cy3B-NHS-ester zoals beschreven in Ma et. al25. Meng 100 μM van de 56 pN TGT-bodemstreng (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) met 50 μg Cy3B-NHS-ester voorgelooid in 10 μL DMSO. Stel de pH van dit mengsel in op 9 met 0,1 M natriumbicarbonaat en breng het uiteindelijke volume op 100 μL met 1x PBS. Incubeer het reactiemengsel een nacht bij RT. Zuiver het mengsel sequentieel met behulp van P2-gelfiltratie en reverse-phase HPLC om niet-gereageerde reagentia, zouten en organische oplosmiddelen te scheiden (beschreven in stappen 1.4 en 1.5). Schat de concentratie van de gezuiverde oligonucleotide-kleurstofconjugaten door hun absorptie bij 260 nm te registreren met behulp van een spectrofotometer. Karakteriseer de gezuiverde producten door MALDI-TOF massaspectrometrie. Los overtollig 3-hydroxypicolinic acid op in TA50-oplosmiddel (50:50 v/v acetonitril en 0,1% TFA in ddH2O) om de verse MALDI-matrix te bereiden. Geschatte en gemeten molecuulgewichten voor de geëtiketteerde producten zijn: cRGDfK-1-BHQ2 – 8157,9 (berekend), 8160,1 (gevonden); Cy3B gelabeld 56 pN TGT – 10272,7 (berekend), 10295,8 (gevonden). Los de bovenste en onderste strengen afzonderlijk op in nucleasevrij water in een concentratie tussen 30-50 μM. Gebruik DNase-vrije pipetpunten om verontreiniging van de voorraad te voorkomen. Bewaren bij 4 °C voor toepassingen op korte termijn of -20 °C voor toepassingen op lange termijn. De stabiliteit van oligonucleotiden wordt niet beïnvloed door herhaalde vries-dooicycli. 2. Voorbereiding van het oppervlak Dag 1: Plaats glazen afdekplaten van 25 mm (maximaal 8) in een polytetrafluorethyleenrek. Plaats het rooster in een borosilicaatbeker van 50 ml met 40 ml 200 proof ethanol. Bedek het bekerglas met paraffinefilm om te voorkomen dat er water binnendringt en soniceer met een werkfrequentie van 35 kHz gedurende 10-15 minuten bij RT (figuur 1A). Vul een bekerglas van 50 ml met 40 ml Piranha-oplossing, vers bereid door zwavelzuur en waterstofperoxide in een verhouding van 3:1 te mengen in een pyrexbeker. Roer met een glazen pipet. Breng het coversliprek over in het bekerglas en incubeer gedurende 30 minuten bij RT in de zuurkast om het coverslipoppervlak te etsen (figuur 1B).OPMERKING: Draag volledige PBM’s, inclusief een laboratoriumjas, handschoenen en een bril, en werk in de chemische zuurkast. Voeg langzaam waterstofperoxide toe aan het zuur om oververhitting van de oplossing te voorkomen. Gebruik na het etsen een pincet om het coversliprek over te brengen naar een bekerglas met ultrapuur water. Herhaal deze stap zes keer met intervallen van 15 s om het zuur volledig te neutraliseren (figuur 1C).OPMERKING: Laat de Piranha-oplossing een nacht in de chemische zuurkast zitten voordat u deze in de zuurafvalcontainer gooit. Inspecteer de coverslips visueel om ervoor te zorgen dat de oppervlakken er schoon uitzien zonder patronen of stofdeeltjes op het glasoppervlak. Herhaal stap 2.1-2.4 als er patronen of stof worden gedetecteerd.OPMERKING: Test de hydrofilie van het oppervlak door behandelde coverslips in water te dopen en verticaal te verwijderen. Water op behandelde coverslips trekt zich terug als een uniform vel om Young’s ringen te vormen in vergelijking met onbehandelde coverslips die patches vormen. Breng het coversliprek over op een bekerglas met 200 proof ethanol en was tweemaal gedurende 15 s om oppervlakken in evenwicht te brengen met organisch oplosmiddel. Breng het coverslip-rek over in 200-proof ethanoloplossing met 3% APTES gedurende 1 uur bij RT om de coverslips te silaniseren (figuur 1D). Bedek het bekerglas met paraffinefolie.OPMERKING: APTES-afzettingsparameters variëren afhankelijk van de oppervlaktereinigingsmethode, het oplosmiddelwatergehalte, aptes-concentratie, incubatietijden en temperatuur voor gloeien. Dompel het rek onder in een schoon bekerglas met 200-proof ethanoloplossing. Herhaal deze was drie keer gedurende 15 s elk (figuur 1E). Droog de afdekplaten met stikstofgas (N2) met een lage uitgangsdruk. Leg de coverslips in een polystyreenschaal van 10 cm met een stuk paraffinefilm er plat in gelegd. Zorg ervoor dat de coverslips droog en gescheiden zijn (figuur 1F). Voeg 100 μL 2 mg/ml NHS-biotineoplossing in DMSO toe aan vier coverslips die op paraffinefilm zijn geplaatst. Zet een “sandwich” met de andere vier coverslips bovenop (twee coverslips naar elkaar gericht met de functionalisatieoplossing ertussen) en incubeer het gerecht een nacht bij 4 °C (figuur 1G).OPMERKING: Bij 4 °C is het NHS-reagens stabieler, wat een uniforme oppervlaktefunctionalisatie mogelijk maakt. Bovendien behoudt de sandwich reagentia. Vermijd het toevoegen van overtollige oplossing in de sandwich, omdat deze kan uitlekken en ervoor kan zorgen dat coverslips wegglijden. Dag 2: Haal het gerecht van 4 °C en scheid de ingeklemde dekens. Richt de slips in het rek met het gecoate oppervlak naar elkaar toe, zoals weergegeven in figuur 2A. Was ze drie keer met 200 proof ethanoloplossing gedurende 15 s per stuk. Droog met N2 gas en doe ze in een nieuwe schaal met een paraffinefilm erin.OPMERKING: Het oriënteren van de coverslips zoals aangegeven helpt bij het identificeren van het gefunctionaliseerde oppervlak. Was de coverslips drie keer met 1 ml 1x PBS om ze weer in evenwicht te brengen naar de waterige fase. Voeg 800 μL 0,1% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS (w/v) toe aan elk van de coverslips en incubeer bij RT gedurende 30 minuten om het oppervlak te passiveren en niet-specifieke binding van daaropvolgende functionalisatiereagentia te blokkeren (figuur 2B). Was na incubatie de coverslips drie keer met 1 ml 1x PBS. Voeg 800 μL 1 μg/ml streptavidin toe in 1x PBS bij RT gedurende 45-60 minuten om de coverslips te functionaliseren (figuur 2C).OPMERKING: Bewaar één afdeksel zonder streptavidin om de passiveringsefficiëntie te controleren (optioneel). Voeg 10 nM gebiotinyleerde moleculen toe en beeld met behulp van experimentele omstandigheden. Deze oppervlakte-intensiteit moet dicht bij de donkere ruis van de camera liggen. Monteer gelijktijdig met stap 2.11 de TGT-sondes (boven: onderste streng bij 1:1 molaire verhouding) bij een eindconcentratie van 50 nM in 100 μL van 1 M NaCl in een PCR-buis met behulp van een thermocycler. Dissociëren van strengen bij 95 °C gedurende 5 minuten en geleidelijk gloeien door de temperatuur te verlagen tot 25 °C en deze gedurende 25 minuten te handhaven (figuur 2D). Vermijd langdurige blootstelling van TGT-sondes aan licht. Gebruik na streptavidin incubatie 1x PBS om de coverslips drie keer te wassen. Voeg 100 μL van de voorgemonteerde TGT-sondes toe aan vier van de coverslips en maak sandwiches met behulp van de resterende 4 coverslips met de gefunctionaliseerde kant naar de sondes gericht (acht oppervlakken vereisen vier buizen van gehybridiseerde TGT-sondes). Dek af met aluminiumfolie en incubeer gedurende 1 uur op RT om sondebinding aan het oppervlak mogelijk te maken (figuur 2E). Na de incubatie scheidt u de boterhammen en wast u de dekens drie keer met 1x PBS. De TGT-oppervlakken zijn nu klaar voor beeldvorming. Monteer de coverslips zorgvuldig in voorgepoetste beeldkamers en voeg 1x PBS toe om de oppervlakken gehydrateerd te houden (figuur 2F).OPMERKING: Het overspannen van de kamers zal het oppervlak kraken. Voorkom uitdroging van de oppervlakken. 3. Celvoorbereiding en kleuring Om het effect van de epidermale groeifactor (EGF) stimulatie op Cos-7-mechanica, adhesie en celverspreiding te onderzoeken, trypsinize Cos-7-cellen met 0,05% Trypsine-EDTA gedurende 2 minuten. Neutraliseer het trypsine door te wassen met HBSS en gedurende 5 minuten te centrifugeren op 800 x g . Herhaal de neutralisatiestap nogmaals. Plaatcellen met een dichtheid van 4 x 104 cellen op de geassembleerde TGT-oppervlakken in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 50 ng/ml EGF of DMEM zonder EGF. Laat de cellen gedurende 60 minuten verspreiden bij 37 °C met 5% CO2 in een celkweekincubator (figuur 3A).OPMERKING: Cellen worden geïncubeerd in DMEM zonder serum om stimulatie door groeifactoren te voorkomen. EGF wordt verdund in 10 mM azijnzuur tot een bouillon van 1 mg/ ml. Het wordt gebruikt bij 50 ng / ml in DMEM voor beeldvormingsexperimenten. Was de cellen na incubatie drie keer met 1x PBS en fixeer met 2 ml 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij RT (figuur 3B).OPMERKING: Alle incubatiestappen worden uitgevoerd op een roterende schudder bij ~ 35 tpm voor een uniforme verspreiding van de oplossingen. Bescherm de TGT-oppervlakken tegen licht door ze te bedekken totdat ze klaar zijn voor beeldvorming. Aspirateer het fixeermiddel en was de coverslips vijf keer met 1x PBS met intervallen van 5 minuten op RT. Incubeer de coverslips eventueel met 50 mM NH4Cl in 1x PBS gedurende 30 minuten bij 37 °C om paraformaldehyde-geassocieerde autofluorescentie te doven en was drie keer met 1x PBS met intervallen van 5 minuten (figuur 3B). Voeg Buffer A (1x PBS, 5% normaal paardenserum, 5% normaal geitenserum, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C om de cellen te blokkeren en te permeabiliseren. Was drie keer met 1x PBS met intervallen van 5 minuten (figuur 3B). Plaats de beeldkamers met coverslips in een vochtcontainer. Verdun het primaire anti-paxilline antilichaam (focale adhesiemarker) op 1:250 in blokkerende buffer (1x PBS, 5% normaal paardenserum, 5% normaal geitenserum, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Incubeer met 200 μL primaire antilichaamoplossing per coverslip gedurende 2 uur bij 37 °C (figuur 3B).LET OP: Laat de oppervlakken niet uitdrogen. Was de coverslips vijf keer met 1x PBS met intervallen van 5 minuten en breng ze terug naar de vochtcontainer. Label cellen gelijktijdig met een mengsel van kleurstof geconjugeerd geiten anti-konijn secundair antilichaam bij 1:800 verdunning en kleurstof geconjugeerd falloïdine (actine) bij 1:400 verdunning in 200 μL blokkerende buffer per coverslip. Incubeer bij 37 °C gedurende 60 minuten (figuur 3B). Was de oppervlakken vijf keer met 1x PBS met intervallen van 5 minuten en bewaar bij 4 °C totdat ze klaar zijn voor beeldvorming (figuur 3B).OPMERKING: Beeldmonsters binnen 3 dagen na oppervlaktevoorbereiding om signaaldegradatie te voorkomen. 4. Beeldacquisitie Gebruik een olie-onderdompeling 60x objectief met een hoog numeriek diafragma (1,49) op een omgekeerde microscoop met 488, 561 en 647 TIRF excitatie, RICM excitatie, een perfect scherpstelsysteem en een digitale camera. Voeg olie toe aan het objectief, reinig de bodem van de afdeksel van de monsterkamer en plaats het monster op het podium. Focus op een cel en betrek de perfecte focus. Zet de microscoop in de RICM-beeldvormingsmodus met epifluorescentie-excitatie en een GFP-filterkubus met het emissiefilter verwijderd. Lijn de RICM uit door het diafragma van de epi-verlichting te sluiten en te centreren. Zet de microscoop in TIRF-modus met laserexcitatie en een quad-pass TIRF-filterkubus. Stel de 488 nm-laser scherp op een kleine plek aan het plafond van de kamer en vergroot de invalshoek tot voorbij de kritieke hoek tijdens het bewaken van fluorescentie op de camera in live-modus. Neem een sterke vermindering van de achtergrondfluorescentie en een enkel in-focusvlak wanneer de kritische hoek wordt overschreden.OPMERKING: TIRF prikkelt een dun gebied (~ 100 nm) dat zich het dichtst bij de sample-coverslip-interface bevindt en open TGT-sondes en focale verklevingen markeert, terwijl onscherpe fluorescentie vanuit de cel wordt geëlimineerd. Als TIRF niet beschikbaar is, kan epifluorescentie worden gebruikt; de signaal-ruisverhoudingen zullen echter lager zijn. Identificeer cellen voor beeldvorming met behulp van de “live” modus van de camera met behulp van RICM. Verkrijg de RICM-afbeelding en TIRF-beelden van actine (640 nm ex), integrinespanning (561 nm ex) en paxilline (488 nm ex). Verkrijg beelden sequentieel met een belichtingstijd van 200 ms.OPMERKING: De belichtingstijd is afhankelijk van vele factoren, waaronder het objectief, het laservermogen, emissiefilters en de gevoeligheid van de camera. Het signaal moet minstens 2x groter zijn dan de achtergrond. De achtergrond is ongeveer 1000 AE, dus het signaal moet ten minste 2000-3000 AE zijn. Herhaal 4.4-4.5 voor ten minste 30 cellen. Wijzig coverslips, focus en herhaal 4.4-4.5. 5. Data-analyse OPMERKING: Voer kwantitatieve beeldanalyse uit met behulp van de Fiji-software en de analyse met behulp van statistiekensoftware. Open de afbeeldingsset voor één cel. Maak een masker van het celgebied (RICM-masker) door de grens van de cel in de RICM-afbeelding over te trekken met het selectiegereedschap ImageJ Freehand. Sla de regio van belang (ROI) op in de ROI-manager (Analyze > Tools > ROI manager) (Figuur 4A1,2). Kies een representatief gebied buiten de cel in de integrin-spanningsafbeelding en teken een ROI van ten minste 200 x 200 pixels. Sluit andere cellen of fluorescerend vuil uit van de ROI. Meet de achtergrondfluorescentie in de ROI met behulp van de meettool (Analyze > Measure) (Figuur 4A3). Trek de gemiddelde achtergrondfluorescentie verkregen in stap 5.2 af van het spanningsbeeld (Proces > Math > Subtract) (figuur 4A4). Gebruik het RICM-masker dat is ingesteld in stap 5.2 om het spanningssignaal binnen de celvoetafdruk te definiëren (ROI-manager > Selecteer > Masker toepassen > Bewerk > Buiten wissen) (Figuur 4A5). Maak een drempelmasker voor het spanningsbeeld met behulp van Huang’s methode voor automatische drempels (Afbeelding > > drempel aanpassen) (figuur 4A6). Zorg ervoor dat het drempelmasker het beste het gebied voor de gegenereerde integrinespanning vertegenwoordigt. Stel als vuistregel de drempel in op 2x de gemiddelde achtergrondfluorescentie. Maak een selectie van het drempelspanningsmasker (Bewerken > Selectie > Maken) (Afbeelding 4A7). Breng het geselecteerde masker over op het spanningsbeeld dat in stap 5.4 is gegenereerd en meet de geïntegreerde intensiteit van open sondes (ROI manager > Select (Tension Mask) > Analyze > Measure > RawIntDen) (Figuur 4C). Meet het gebied, de circulariteit en de hoogte-breedteverhouding van de celmorfometrische eigenschappen van het RICM-masker (ROI manager > Select (RICM-masker) > Masker toepassen > Analyseren > meten) (afbeelding 4B). Meet de mechanische breukdichtheid, gedefinieerd als het percentage van de celvoetafdruk met gescheurde sondes door de afbeelding van het spanningsmasker te selecteren en het RICM-masker (ROI manager > Select (RICM-masker) toe te passen > Analyseren > meten > %Gebied) (figuur 4C). Exporteer de metingen voor verdere analyse en visualisatie naar statistische software. Herhaal 5.1-5.11 voor elke cel.

Representative Results

Turn-on TGT-sondes werden gebruikt om het effect van ligand-geactiveerde epidermale groeifactorreceptor (EGFR) op integrine-gemedieerde celmechanica en adhesievorming in Cos-7-cellente onderzoeken 21. De sondes presenteren het ligand cyclische Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)21,23,25,26, dat selectief is voor het integrine heterodimeer αVβ3 met slechts een kleine affiniteit voor α5β1-integrinen 27,28,29,30. De TGT-sonde bestaat uit een duplex-DNA dat via de onderste streng op een glazen dekvlak wordt gefunctionaliseerd met behulp van biotine-streptavidinbinding. De bovenste streng toont het integrineligand en is beschikbaar om te binden aan de cognate-integrinereceptor op het celmembraan (figuur 5A). De onderste streng is gelabeld met een fluorofoor en de bovenste streng met een quencher, wat leidt tot minimale achtergrondfluorescentie wanneer de duplex TGT intact is. Als een integrine het ligand bindt en een kracht uitoefent met een magnitude groter dan deT-tol van de sonde, zal de DNA-duplex scheiden, wat leidt tot fluorescentie (figuur 5A). Elke TGT-sonde die niet door een mechanische kracht is gescheurd, blijft niet-fluorescerend. Deze krachtselectieve inschakelfluorescentie maakt systematische en kwantitatieve mapping van pN-schaal integrine-gegenereerde krachten bij diffractie-beperkte resolutie mogelijk. TGT-sondes moduleren bovendien de spanningsdrempel van het substraat. Hier is een representatief voorbeeld te zien van een TGT-oppervlak met eenT-tol van 56 pN. Cos-7-cellen werden op dit TGT-oppervlak met of zonder EGF-stimulatie geplaatst om de impact van EGFR-activering met ligandstimulatie op celadhesie en integrinemechanica te bestuderen (figuur 5A, B). De cellen werden geïncubeerd met of zonder EGF op de TGT-oppervlakken gedurende 60 minuten, vast en immuno-gekleurd om de focale adhesieverdeling (paxilline) en de organisatie van het cytoskelet (F-actine) weer te geven (figuur 5B). De cellen werden vervolgens in beeld gebracht met behulp van RICM- en TIRF-microscopie. Zoals duidelijk te zien is in de RICM-afbeelding, werd de verspreiding van Cos-7-cellen op het 56 pN TGT-oppervlak aanzienlijk verbeterd met EGF-stimulatie in vergelijking met zonder stimulatie. Dit werd gekwantificeerd voor 50 cellen in elke toestand door de grootte van het cel-substraatcontactgebied te meten op basis van het RICM-beeld (figuur 5C). Stimulatie met EFG resulteerde in een meer circulaire morfologie, representatief voor Cos-7-cellen die zich verspreiden en groeien in hun natuurlijke fysiologische omgeving (figuur 5D). De fluorescentie van open sondes is ook hoger met EGF-stimulatie zoals waargenomen in het spanningsfluorescentiebeeld. De geïntegreerde intensiteit van open sondes, die evenredig is met het aantal open sondes, was veel hoger bij EGF-stimulatie in vergelijking met zonder (figuur 5B,E). Dit is een weergave van alle receptor-ligand engagementen waarbij integrinen een kracht groter dan Ttol (56 pN) uitoefenden. Kleuring met paxilline toonde aan dat de verdeling, het aantal, de rijping (grootte) en de organisatie van focale verklevingen ook werden beïnvloed door EGF-stimulatie. Focale verklevingen in EGF-gestimuleerde cellen leken volwassener en radiaal georiënteerd in vergelijking met geen EGF-controles. De F-actine cytoskeletale organisatie werd ook versterkt met EGF-stimulatie, zoals beoordeeld door de falloïdinekleuring (figuur 5B). Deze kwalitatieve beoordelingen werden gemaakt door visuele vergelijking van beelden van beide behandelgroepen. Kwantitatieve analyse van focale adhesie kan worden gedaan, maar valt buiten het bestek van dit protocol. In dit experiment bood het TGT-oppervlak een platform om systematisch het effect van EGFR-activering op celverspreiding, integrinemechanica en focale adhesievorming te beschrijven. Figuur 1: Schema voor dag 1 van de TGT-oppervlaktevoorbereiding. (A) Reinig de coverslips. (B) Het oppervlak van de coverslip etsen. (C) Neutraliseer de Piranha-oplossing. (D) Silaniseer het oppervlak om reactieve aminegroepen te maken. (E) Breng de coverslips in evenwicht met de organische fase. (F) Droog de deklips met een inert gas. (G) Biotinylaat de oppervlakte-aminegroepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Schema voor dag 2 van de TGT-oppervlaktevoorbereiding. (A) Reinig en droog de coverslips om eventuele resterende biotine van de dag ervoor te verwijderen. (B) Passiveer met BSA om niet-specifieke binding van reagens in volgende stappen te voorkomen. (C) Functionaliseer de coverslips met streptavidin. (D) Hybridiseer de sondes in een thermo cycler. (E) Breng de gesynthetiseerde sondes aan op de coverslips (F) Monteer de coverslip in de celbeeldvormingskamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Algemene workflow met de brede stappen in de gehele experimentele opstelling. (A) Proces voor celloslating en beplating op het TGT-oppervlak in basale media (DMEM) met of zonder EGF-stimulatie. (B) Stroomdiagram van de stappen die betrokken zijn bij fixatie en immunokleuring na bevestiging en verspreiding op het TGT-oppervlak. (C) Na de kleuring worden cellen afgebeeld op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met RICM- en TIRF-microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Voorbeeld van gegevensverwerking en kwantitatieve analyse. (A) Stapsgewijze uitsplitsing van de analysepijplijn die in Fiji wordt gebruikt (ImageJ) voor RICM- en spanningsbeeldkwantificering. (B) Een representatief voorbeeld voor celmorfometrische uitkomsten geanalyseerd met behulp van de bovenstaande pijplijn. (C) Representatieve voorbeelden voor celmechanische uitkomsten geanalyseerd met behulp van de bovengenoemde pijplijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Voorbeeldgegevens van een TGT-experiment. (A) Diagram met de contactzone op de celmembraan-TGT-oppervlakte-interface. Inzetprojecten die interageren met zijn verwante ligand cRGDfK met (rechts) of zonder (links) EGF-stimulatie. (B) RICM- en TIRF-beelden van Cos-7-cellen verspreid over het 56 pN TGT-oppervlak. De beelden worden verkregen 60 minuten na het plateren met of zonder EGF-stimulatie. Individuele RICM (zoals verworven), integrinespanning (grijswaarden), paxilline (oranje heet) en F-actine (blauwgroen) beelden worden getoond met overlays voor beide stimulatieomstandigheden. Schaalbalk: 10 μm. De inzet benadrukt een ingezoomde ROI (regio van belang) die de colocalisatie van de gegenereerde integrinespanning op plaatsen van adhesievorming gemarkeerd door paxilline en de onderliggende subcellulaire cytoskeletale organisatie gemarkeerd door actine beschrijft. Schaalbalk: 5 μm. (C-E) Scatter plots voor het verspreidingsgebied (RICM celvoetafdruk) (C), circulariteit (D) en geïntegreerde spanning (E) voor Cos-7-cellen met of zonder EGF-stimulatie. Balken geven de gemiddelde ± s.d. Verschillen tussen de groepen werden statistisch beoordeeld met student t-test; P < 0,0001. n = 50 cellen in drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Voorbeeld TGT-oppervlakken met verschillende mogelijke problemen. (A) Spannings- en RICM-beelden van een ideaal TGT-oppervlak met geassembleerde sonde geblust vóór celhechting. (B) Spannings- en RICM-beelden van een TGT-oppervlak waar de TGT-sonde de bovenste streng (quencher) mist. Spanningsbeeld toont uniforme fluorescentie van open fluorofoor in de onderste streng. (C) Spannings- en RICM-beelden voor cellen verspreid over een ideaal TGT-oppervlak. (D) Spannings- en RICM-beelden voor cellen verspreid over een slecht gemaakt TGT-oppervlak met beperkte passivering of gedegradeerde sonde. (E) Spannings-, RICM- en brightfield-beelden voor cellen die op een ideaal oppervlak zijn geplaatst met cRGDfK-ligand dat cRGDfK-integrine-interacties aangeeft, zijn van vitaal belang voor celaanhechting en spanningsgeneratie. (F) Spannings-, RICM- en brightfield-beelden voor cellen die zijn verguld op een oppervlak zonder cRGDfK-ligand op de TGT. Hoewel de cellen zichtbaar zijn in het brightfield-beeld, wordt er geen celaanhechting of gegenereerde integrinespanning waargenomen. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Met de gedetailleerde stapsgewijze procedure die hierboven is beschreven, kan men TGT-oppervlakken voorbereiden om celmorfologie en integrinespanning te kwantificeren die worden gegenereerd door hechtende cellen tijdens celaanhechting en verspreiding na behandeling met EGF. Het eenvoudige sondeontwerp en de synthese en oppervlaktevoorbereiding samen met de eenvoudige experimentele opstelling boden een stabiel platform om de interactie van EGFR en integrinen te bestuderen. Over het algemeen bevestigen de resultaten dat ligandafhankelijke activering van EGFR de celverspreiding verbetert, de krachtdragende eigenschappen van integrinereceptoren afstemt en de focale adhesieorganisatie en rijping bevordert. De resultaten verkregen met behulp van TGT-sondes ondersteunen de overkoepelende hypothese dat groeifactoren, zoals EGFR, fungeren als ‘mechano-organisatoren’, waardoor de hoeveelheid en ruimtelijke organisatie van integrinespanning toeneemt en de oriëntatie en mechanica van focale verklevingen wordt gereguleerd.

Bij het aanbrengen op het TGT-oppervlak landen, hechten en verspreiden de cellen zich terwijl de integrine (αVβ3) receptoren het cRGDfK-ligand detecteren en eraan binden. Daarbij kunnen de TGT-sondes mechanisch worden gescheurd, waardoor fluorescentie wordt gegenereerd op de plaats van ligandbetrokkenheid. De uitlezing is de cumulatieve “krachtgeschiedenis” van de cel die interageert met het oppervlak. Er zijn enkele veelvoorkomende problemen met de TGT-oppervlakken die tijdens deze experimenten aanwezig kunnen zijn. Achtergrondfluorescentie met een hoog oppervlak (figuur 6A, B), fragmentarisch oppervlak, falen van de cellen om spanningssignaal te genereren (figuur 6C, D) en falen van cellen om zich te verspreiden (figuur 6E, F) kunnen te wijten zijn aan technische tekortkomingen met de TGT-sonde of oppervlaktesynthese. Oplossingen voor deze veelvoorkomende problemen zijn weergegeven in tabel 1.

Het eenvoudige ontwerp van TGT-sondes biedt celbiologen een krachtig hulpmiddel om specifieke groeifactor-integrine signaleringsresultaten geïsoleerd te bestuderen zonder interferentie van andere celoppervlakreceptoren door alleen specifieke liganden en stimulaties te bieden. Bovendien maken TGT-sondes onderzoek mogelijk naar de spanningsdrempel die individuele integrinereceptoren onderstreept tijdens celadhesie bij pN-gevoeligheid. Alternatieve benaderingen rapporteren geen krachten uitgeoefend door individuele receptoren met een hoge ruimtelijke resolutie in vaste monsters31. Tractiekrachtmicroscopie is alleen gevoelig voor nN-krachten, een orde van grootte hoger dan de krachten die worden uitgeoefend door individuele integrinereceptoren15, en moleculaire spanningsondes meten pN-krachten, maar omdat ze omkeerbaar zijn, zijn ze niet robuust bestand tegen fixatie. Om deze redenen zijn TGT-sondes een aantrekkelijk hulpmiddel om de mechanica van groeifactor-integrine-interacties te bestuderen.

Er zijn verschillende technische nuances geassocieerd met TGT-sondes die moeten worden overwogen voordat een experiment wordt ontworpen. Het spanningsbeeld is een momentopname in de tijd, die de krachtgeschiedenis vertegenwoordigt en geen indicator is van de receptor-ligandbetrokkenheid op een bepaald tijdstip. Aangezien signaalgeneratie afhankelijk is van sondescheiding, is de TGT-fluorescentie het resultaat van open sondes die niet onder actieve spanning staan van receptor-ligandbetrokkenheid. Dit betekent dat de uitlezing voor de geïntegreerde spanning die op het TGT-oppervlak wordt verkregen, historisch en cumulatief van aard is en weergeeft waar er krachten groter waren danT-tol; de locaties van de huidige receptor-ligandkrachten kleiner dan Ttol worden niet gerapporteerd19,32. Omdat TGT-breuk resulteert in beëindiging van de receptor-ligandbetrokkenheid, is celverspreiding te wijten aan integrine-ligandinteracties die krachten ervaren die lager zijn danT-tol. De gebruiker moet daarom voorzichtig zijn bij het definiëren van de tijd na het plateren om de mechanische uitkomsten te schatten die verband houden met op integrine gebaseerde verklevingen. Ten slotte moet de betekenis vanT-tol worden overwogen. De TGT-sondes die hier worden gebruikt, hebben eenT-tol van 56 pN, waarbijT-tol de constante kracht is die nodig is om 50% van de sondes te scheuren wanneer ze gedurende 2 s worden toegepast. Bij het overwegen van gecompliceerde biologische systemen ervaren TGT’s waarschijnlijk een heterogene en diverse krachtgradatie met verschillende tijdsafhankelijkheden. Als TGT’s worden gescheurd door krachten groter danT-tol, zou de fluorescentie een onderschatting zijn van de totale spanning. Als alternatief kunnen krachten onderT-tol die voor langere duur worden toegepast, een vergelijkbaar aantal sondes scheuren als hoge drempelkrachten die korter worden toegepast. Beide scenario’s kunnen resulteren in dezelfde fluorescentie-intensiteitsuitlezing, waardoor het moeilijk is om de exacte spanningsomvang of -dynamiek op te lossen met behulp van TGT-sondes33,34.

Over het algemeen moeten beoordelingen van integrinespanning met groeifactorstimulatie zorgvuldig worden uitgevoerd door experimenten met interne controles te ontwerpen, verspreidingsprofielen op andere matrixgecoate oppervlakken te vergelijken, parallelle beoordelingen te maken van TGT-fluorescentie in cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van groeifactorstimulatie, en TGT’s te gebruiken met verschillendeT-tol . TGT’s maken kwantificering mogelijk van de rol van groeifactorsignalering bij het reguleren van de mechanica van integrinereceptoren, focale adhesiedynamica en celverspreiding. Dit protocol kan worden gebruikt als een sjabloon voor veel op TGT gebaseerde experimenten met behulp van sondes met verschillendeT-tol, verschillende liganden, verschillende celtypen of verschillende stimulatieomstandigheden. Alle eiwitten van belang kunnen na fixatie worden gelabeld en elk type kwantitatieve beeldanalyse kan worden geïmplementeerd. Als zodanig presenteren we een sjabloon voor tal van TGT-experimenten.

Het gebruik van TGT-sondes is niet beperkt tot het bestuderen van integrinen, maar kan worden uitgebreid tot een breed scala aan celmembraanreceptoren in verschillende celtypen door het ligand te wijzigen. TGT-sondes zijn gebruikt om de rol van krachten bij het reguleren van verschillende receptorsignaleringscascades te onderzoeken, waaronder het identificeren van de mechanische rol van notch-receptormechanica in embryonale ontwikkeling en neurogenese35, de krachten die de identificatie en internalisering van antigenen door B-celreceptoren bemiddelen36, en het mechanische proefleesvermogen van T-celoppervlakreceptoren om veranderingen in krachten te detecteren om de sterkte en specificiteit van signaaloverdracht te vergroten37 . Samen benadrukken deze bevindingen het immense potentieel van TGT-sondes in verschillende experimentele omgevingen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de leden van het Mattheyses-laboratorium bedanken voor vruchtbare discussies en kritieken. We erkennen financiering aan A.L.M. van NSF CAREER 1832100 en NIH R01GM131099.

Materials

(3-Aminopropyl)triethoxysilane Millipore Sigma 440140 Surface Preparation
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) Millipore Sigma 56197 Maldi-TOF-MS matrix
Acetic Acid, Glacial Fisher Scientific A38S Diluting EGF
Acetonitrile (HPLC) Fisher Scientific A998SK Oligonucleotide Preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin Cell Signaling Technology 8878S Immunocytochemistry
Ammonium Chloride Fisher Scientific A687 Immunocytochemistry
Anti-Paxillin antibody [Y113] Abcam ab32084 Immunocytochemistry
BD Syringes only with Luer-Lok BD bioscience 309657 Surface Preparation
Bio-Gel P-2 Bio-Rad 1504118 Oligonucleotide Preparation
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100 Surface Preparation
Cos-7 cells ATCC CRL-1651 Cell Culture, Passage numbers 11-20
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784 Surface Preparation
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid Vivitide PCI-3696-PI Oligonucleotide Preparation
Cy3B NHS ester GE Healthcare PA63101 Oligonucleotide Preparation
Dimethylformamide Millipore Sigma PHR1553 Oligonucleotide Preparation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013C Cell Culture
Epidermal Growth Factor human EGF Millipore Sigma E9644 Cell Culture
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22032601 Surface Preparation
Falcon Standard Tissue Culture Dishes Fisher Scientific 08-772E Surface Preparation
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-438-026 Cell Culture
Flurobrite DMEM Fisher Scientific A1896701 Cell Culture
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21244 Immunocytochemistry
Goat Serum Fisher Scientific 16-210-064 Immunocytochemistry
Hank’s balanced salts (HBSS) Fisher Scientific 14-170-161 Cell Culture
Horse Serum Fisher Scientific 16050130 Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-500 Surface Preparation
Nanosep MF centrifugal devices Pall laboratory ODM02C35 Oligonucleotide Preparation
NHS-azide Fisher Scientific 88902 Oligonucleotide Preparation
Nitrogen Gas Cylinder Airgas Surface Preparation
No. 2 round glass coverslips – 25 mm VWR 48382-085 Surface Preparation
Parafilm M Laboratory Film Fisher Scientific 13-374-10 Surface Preparation
Paraformaldehyde 16% Fisher Scientific 50-980-487 Immunocytochemistry
PBS, 1X Fisher Scientific 21-030-CV Surface Preparation/Immunocytochemistry
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Fisher Scientific 15-070-063 Cell Culture
PYREX Low Form Griffin Beakers Fisher Scientific 02-540G Surface Preparation
Sodium Ascorbate Fisher Scientific 18-606-310 Oligonucleotide Preparation
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233 Oligonucleotide Preparation
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358 Surface Preparation
Streptavidin Fisher Scientific 434301 Surface Preparation
Sulfo-NHS-LC-Biotin Fisher Scientific 21335 Surface Preparation
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300-500 Surface Preparation
TEAA Fisher Scientific NC0322726 Oligonucleotide Preparation
Triethylamine Millipore Sigma 471283 Oligonucleotide Preparation
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific PI28901 Oligonucleotide Preparation
THPTA Fisher Scientific NC1296293 Oligonucleotide Preparation
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution Fisher Scientific 85111 Immunocytochemistry
Water, DNA Grade, DNASE, Protease free Fisher Scientific BP24701 Oligonucleotide Preparation
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm Agilent 653950-702 Oligonucleotide Preparation
High-performance liquid chromatography Agilent 1100 Oligonucleotide Preparation
Low Speed Orbital Shaker Fisher Scientific 10-320-813 Immunocytochemistry
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) Voyager STR Oligonucleotide Preparation
Molecular Probes Attofluor Cell Chamber Fisher Scientific A7816 Surface Preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Oligonucleotide Preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope pe Nikon Microscopy
Nikon Perfect Focus System Nikon Microscopy
NIS Elements software Nikon Microscopy
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu Microscopy
Quad band TIRF 405/488/561/647 cube CHROMA Microscopy
RICM Cube CHROMA Microscopy
SOLA v-nIR Light Engine Lumencor Microscopy
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator Fisher Scientific Cell Culture
VWR 75D Ultrasonic Cleaner VWR 13710 Surface Preparation
Data Analysis Use
Fiji (Image J) https://imagej.net/software/fiji/downloads Quantitative Analysis
Graph Pad Prism Graph Pad Statistical Analysis
Oligo name 5'modification/ 3' modification Sequence (5' to 3') Use
Alkyne-21-BHQ2 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 GTGAAATACCGCACAGATGCG Top strand TGT probe
56 pN TGT 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT Bottom strand TGT probe
12 pN TGT 5' AmMC6/ 3' BioTEG CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT Bottom strand TGT probe
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lim, C. -. G., Jang, J., Kim, C. Cellular machinery for sensing mechanical force. BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).
  2. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. (Micro)managing the mechanical microenvironment. Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).
  3. Vogel, V., Sheetz, M. P. Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering. Nanotechnology. , 233-303 (2010).
  4. Wang, J. H. C., Li, B. Mechanics rules cell biology. BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16 (2010).
  5. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
  6. Streuli, C. H., Akhtar, N. Signal co-operation between integrins and other receptor systems. Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).
  7. Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg. Science Signaling. 11 (515), (2018).
  8. Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).
  9. De Luca, A., et al. The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment. Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).
  10. Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors. European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083 (2020).
  11. Eliceiri, B. P. Integrin and growth factor receptor crosstalk. Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).
  12. Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901. OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).
  13. Giancotti, F. G., Tarone, G. Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling. Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).
  14. Ricono, J. M., et al. Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis. Pesquisa do Câncer. 69 (4), 1383-1391 (2009).
  15. Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
  16. Hang, X., et al. Nanosensors for single cell mechanical interrogation. Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086 (2021).
  17. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  18. Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection. Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).
  19. Ma, V. P. -. Y., Salaita, K. DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems. Small. 15 (26), 1900961 (2019).
  20. Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways. Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).
  21. Rao, T. C., et al. EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation. Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).
  22. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  23. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  24. Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).
  25. Ma, V. P. -. Y., et al. Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).
  26. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  27. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).
  28. Kantlehner, M., et al. Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation. ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).
  29. Kapp, T. G., et al. A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins. Scientific Reports. 7, 39805 (2017).
  30. Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).
  31. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
  32. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  33. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  34. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2019).
  35. Luca, V. C., et al. Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity. Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).
  36. Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
  37. Brockman, J. M., Salaita, K. Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells. Frontiers in Physics. 7, 14 (2019).

Tags

Tension Gauge TetherIntegrin MechanicsCell AdhesionEGFR-Integrin CrosstalkSurface FunctionalizationAPTES SilanizationNHS-BiotinCell MechanicsBioengineering Protocols

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Rao, T. C., Mattheyses, A. L. Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion. J. Vis. Exp. (180), e63529, doi:10.3791/63529 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image