用于量化生长因子介导的整合素力学和附着力的张力计系绳探头

1. TGT寡核苷酸制备 注意：这里概述了寡核苷酸探针合成的细节。请注意，一些修改和纯化步骤可以外包用于定制合成。 将环[阿根廷-Gly-Asp-D-Phe-Lys（PEG-PEG）]肽的伯胺与张等人22 描述的叠氮化物-NHS连接子一起激活，方法是在最终体积为10μL二甲基甲酰胺的1：1.5比例（100：150nmoles）中混合。加入0.1μL有机碱三乙胺，并在4°C下孵育12小时。 使用0.1 M TEAA（溶剂A）和100%乙腈（溶剂B）通过反相HPLC纯化产物，流速为1mL / min，10%溶剂B的初始条件设定在0.5%/分钟的梯度下。结合洗脱的峰（203nm处的吸光度）并通过MALDI-TOF质谱进行验证。该产品是氯化碳基苯叠氮化物。 为了生成TGT顶链，将cRGDfK-叠氮化物和炔基-21-BHQ2寡核苷酸（TGT顶链：5己炔基/GTGAAATACCGATGCAGG/3BHQ_2）以2：1的比例（͂200μM：100μM）与100μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）与5mM抗坏血酸钠和0.1μM预制的Cu-THPTA中混合。让反应在室温（RT）下进行至少4小时或在4°C下过夜。 通过P2脱盐凝胶处理混合物以除去多余的染料，副产物，有机溶剂和未反应的试剂。用650μL预水合P2凝胶准备离心柱，方法是将其以18，000× g 旋转1分钟。丢弃流过的液体并加入反应混合物。再次以18，000 x g 旋转1分钟并收集流过。用超纯水将反应混合物的最终体积降至300μL。注意：用水预水合P2凝胶6小时。 通过反相HPLC纯化脱盐的反应混合物。用于这种纯化的有机溶剂包括H2O（溶剂A）中的0.1 M TEAA和100%MeCN（溶剂B，或流动相）。 在注入混合物之前，以10%溶剂B的初始条件以1%/min的梯度平衡色谱柱。将流速调节至 1 毫升/分钟。用500μL注射针将反应混合物注入HPLC回路。 通过可视化DNA在260nm处的峰吸收和BHQ2淬灭剂在560nm处的峰值吸收来收集产物。将洗脱产物在真空离心浓缩器中干燥过夜。 采用亲核取代将TGT底链偶联到Cy3B-NHS酯上，如Ma等人所述。25.将100微米的56 pN TGT底链（5生物素/ΒTTT/iUniAmM/CGCTGTGGT）与50微克预溶于10μLDMSO中的Cy3B-NHS酯混合。用0.1 M碳酸氢钠将此混合物的pH值调节至9，并用1x PBS将最终体积降至100μL。将反应混合物在室温下孵育过夜。 使用P2凝胶过滤和反相HPLC依次纯化混合物，以分离未反应的试剂，盐和有机溶剂（在步骤1.4和1.5中描述）。 通过使用分光光度计记录其在260nm处的吸光度来估计纯化的寡核苷酸染料偶联物的浓度。 通过马尔迪-TOF质谱表征纯化产物。将过量的3-羟基吡啶甲酸溶解到TA50溶剂（50：50 v / v乙腈和ddH2O中0.1%TFA）中以制备新鲜的MALDI基质。标记产品的估计和测量分子量为：cRGDfK-1-BHQ2 – 8157.9（计算），8160.1（发现）;Cy3B 标记为 56 pN TGT – 10272.7（计算结果），10295.8（已找到）。 将顶部和底部链分别溶解在浓度在30-50μM之间的无核酸酶水中，使用不含DNA酶的移液器吸头以避免库存污染。储存在4°C下用于短期应用，或在-20°C下用于长期应用。寡核苷酸的稳定性不受反复冻融循环的影响。 2. 表面处理 第1天： 将 25 mm 玻璃盖玻片（最多 8 个）放入聚四氟乙烯机架中。将培养架放入装有 40 mL 200 证明乙醇的 50 mL 硼硅酸盐烧杯中。用石蜡膜覆盖烧杯，以避免水进入，并在室温下以35 kHz的工作频率超声处理10-15分钟（图1A）。 在 50 mL 烧杯中加入 40 mL 食人鱼溶液，该溶液是通过将硫酸和过氧化氢以 3：1 的比例混合在吡咯烧杯中新鲜制备的。用玻璃移液器搅拌。将盖玻片架转移到烧杯中，并在通风橱中室孵育30分钟以蚀刻盖玻片表面（图1B）。注意：穿戴全套个人防护用品，包括实验室外套、手套和护目镜，并在化学通风橱中工作。缓慢地将过氧化氢加入到酸中，以防止溶液过热。 蚀刻后，使用镊子将盖玻片架转移到装有超纯水的烧杯中。以15 s的间隔重复此步骤六次，以完全中和酸（图1C）。注意：将食人鱼溶液留在化学通风橱中过夜，然后将其丢弃到酸性废物容器中。 目视检查盖玻片，以确保表面看起来干净，玻璃表面上没有图案或灰尘颗粒。如果检测到图案或灰尘，请重复步骤2.1-2.4。注意：通过将处理过的盖玻片浸入水中并垂直移除来测试表面亲水性。与未经处理的盖玻片形成斑块相比，处理过的盖玻片上的水会以均匀的薄片形式消退以形成杨氏环。 将盖玻片架转移到装有200乙醇的烧杯中，洗涤两次，持续15秒，使表面平衡成有机溶剂。将盖玻片架转移到具有3%APTES的200证明乙醇溶液中，在室温下1小时使盖玻片硅烷化（图1D）。用石蜡膜覆盖烧杯。注意：APTES沉积参数因表面清洁方法、溶剂含水量、APTES浓度、孵育时间和退火温度而异。 将机架浸入装有200证明乙醇溶液的干净烧杯中。重复此洗涤三次，每次15秒（图1E）。 使用低出口压力的氮气（N2）干燥盖玻片。将盖玻片放入10厘米的聚苯乙烯培养皿中，其中有一块石蜡膜平放。确保盖玻片干燥并分离（图1F）。 将100μL 2mg / mL NHS生物素溶液加入DMSO中，加入到放置在石蜡膜上的四个盖玻片中。将其他四个盖玻片放在顶部（两个盖玻片彼此相对，功能化溶液之间）设置一个“三明治”，并将培养皿在4°C下孵育过夜（图1G）。注意：在4°C时，NHS试剂更稳定，这有助于均匀的表面官能化。此外，三明治还可节省试剂。避免在三明治中添加多余的溶液，因为它可能会泄漏并导致盖玻片滑落。 第2天： 将盘子从4°C中取出，分离夹在中间的盖玻片。如图 2A 所示，使镀膜表面彼此朝向，定位机架中的滑道。用200证明的乙醇溶液洗涤三次，每次15秒。用N2 气体干燥，并将它们放入装有石蜡膜的新培养皿中。注：按照指示定向盖玻片有助于识别功能化表面。 用1 mL 1x PBS洗涤盖玻片三次，以使其平衡回水相。向每个盖玻片中加入800μL 0.1%牛血清白蛋白（BSA）在1x PBS（w / v）中，并在RT下孵育30分钟以钝化表面并阻断后续功能化试剂的非特异性结合（图2B）。 孵育后，用1 mL 1x PBS洗涤盖玻片三次。在室温下在1x PBS中加入800μL1μg/ mL链霉亲和素45-60分钟，以使盖玻片功能化（图2C）。注：保留一个不含链霉亲和素的盖玻片以验证钝化效率（可选）。使用实验条件添加10 nM生物素化分子和图像。此表面强度应接近相机的暗噪点。 与步骤2.11同时，使用热循环仪在PCR管中以50nM的最终浓度在100μL的1M NaCl中组装TGT探针（顶部：以1：1摩尔比的底部链）。在95°C下解离链5分钟，并通过将温度降低至25°C并保持25分钟来逐渐退火（图2D）。避免 TGT 探头长时间暴露在光线下。 链霉亲和素孵育后，使用1x PBS洗涤盖玻片三次。将100μL预组装的TGT探针加入其中四个盖玻片中，并使用剩余的4个盖玻片制作三明治，功能化侧朝向探针（八个表面需要四管杂交TGT探针）。用铝箔覆盖并在室温下孵育1小时，以允许探针与表面结合（图2E）。 孵育后，将三明治分开，并用1x PBS清洗盖玻片三次。TGT 表面现在已准备好进行成像。小心地将盖玻片组装到预清洁的成像室中，并加入1x PBS以保持表面水合（图2F）。注意：过度拧紧腔室会使表面破裂。防止表面干燥。 3. 细胞制备和染色 为了研究表皮生长因子（EGF）刺激对Cos-7力学，粘附和细胞扩散的影响，用0.05%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化Cos-7细胞2分钟。通过用HBSS洗涤并以800× g 离心5分钟来中和胰蛋白酶。再次重复中和步骤。 在杜贝克科的改性鹰培养基（DMEM）中组装的TGT表面上以4 x 104 个细胞的密度平板细胞，并补充50 ng / mL EGF或不含EGF的DMEM。让细胞在37°C下在细胞培养箱中用5%CO2 扩散60分钟（图3A）。注意：细胞在没有血清的情况下在DMEM中孵育，以避免生长因子的刺激。将EGF在10 mM乙酸中稀释以制成1mg / mL的储备。它在DMEM中以50 ng / mL的速度用于成像实验。 孵育后，用1x PBS洗涤细胞三次，并在室温下用2mL 4%多聚甲醛固定12分钟（图3B）。注意：所有孵育步骤均在旋转摇床上以~35 rpm的速度进行，以使溶液均匀分布。通过覆盖TGT表面直到它们准备好成像来保护它们免受光线照射。 抽吸固定剂并用1x PBS在室温下以5分钟间隔洗涤盖玻片5次，任选地，将盖玻片与50mM NH4Cl在1x PBS中在37°C下孵育30分钟以淬灭多聚甲醛相关的自发荧光，并以5分钟间隔用1x PBS洗涤三次（图3B）。 加入缓冲液A（1x PBS，5%正常马血清，5%正常山羊血清，1%BSA，0.025%曲肽X-100）并在37°C下孵育30分钟以阻断和透化细胞。每隔5分钟用1x PBS洗涤三次（图3B）。 将带有盖玻片的成像室放在湿度容器中。在封闭缓冲液（1x PBS，5%正常马血清，5%正常山羊血清，1%BSA，0.005%Triton x-100）中以1：250稀释原代抗帕西林抗体（局灶性粘附标志物）。在每个盖玻片下与200μL一抗溶液在37°C下孵育2小时（图3B）。注意：不要让表面变干。 用1x PBS每隔5分钟洗涤盖玻片五次，然后将其返回到湿度容器中。同时用染料偶联的山羊抗兔二抗混合物以1：800稀释和染料偶联的鬼笔环蛋白（肌动蛋白）的混合物在200μL封闭缓冲液中以1：400稀释每个盖玻片。在37°C孵育60分钟（图3B）。 以5分钟间隔用1x PBS洗涤表面五次，并在4°C下储存，直到准备好成像（图3B）。注意：在表面处理后3天内对图像样品进行图像处理，以避免信号衰减。 4. 图像采集 在具有488，561和647 TIRF激发，RICM激发，完美对焦系统和数码相机的倒置显微镜上使用具有高数值孔径（1.49）的油浸式60x物镜。 向物镜中加入油，清洁样品室的盖玻片底部，然后将样品放在载物台上。专注于细胞并吸引完美的焦点。 将显微镜置于RISM成像模式，并去除发射滤光片，将GFP滤光片立方体移除。通过关闭落射照明光圈光圈并使之居中来对齐RICM。 将显微镜置于TIRF模式，激光激发和四通TIRF滤光片立方体。将488 nm激光聚焦到房间天花板上的一个小点上，并增加入射角直至超过临界角，同时以实时模式监控摄像机上的荧光。观察背景荧光的急剧减少和超过临界角时单个聚焦平面。注意：TIRF激发最靠近样品盖玻片界面的薄区域（~100 nm），突出显示开放的TGT探针和焦点粘连，同时消除细胞内的失焦荧光。如果TIRF不可用，可以使用落射荧光;但是，信噪比会更低。 使用 RICM 的相机的“实时”模式识别要成像的细胞。 获取肌动蛋白（640 nm ex）、整合素张力（561 nm ex）和帕西林（488 nm ex）的 RICM 图像和 TIRF 图像。使用200 ms的曝光时间按顺序获取图像。注意：曝光时间取决于许多因素，包括物镜、激光功率、发射滤光片和相机灵敏度。信号应至少比背景大 2 倍。背景在1000 AU左右，因此信号应至少为2000-3000 AU。 对至少30个细胞重复4.4-4.5。更改封面单，对焦，然后重复4.4-4.5。 5. 数据分析 注：使用斐济软件进行定量图像分析，并使用统计软件进行分析。 打开一个单元格的图像集。 通过使用 ImageJ 手绘 选择工具跟踪 RICM 图像中单元格的边界，创建单元格区域的蒙版（RICM 蒙版）。将感兴趣区域 （ROI） 保存到 ROI 管理器（分析>工具> ROI 管理器）（图 4A1，2）。 在积分张力图像中选取单元格外的代表性区域，并绘制至少 200 x 200 像素的 ROI。从ROI中排除任何其他细胞或荧光碎片。使用测量工具测量ROI中的背景荧光（分析>测量）（图4A3）。 从张力图像中减去步骤5.2中获得的平均背景荧光（处理>数学>减去）（图4A4）。 使用在步骤5.2中建立的RICM掩模来定义单元封装内的张力信号（ROI管理器>选择>应用掩模>编辑>清除外部）（图4A5）。 使用黄的自动阈值方法（图像>调整>阈值）为张力图像创建阈值蒙版（图4A6）。确保阈值掩码最能代表生成的积分张力区域。根据经验，将阈值设置为平均背景荧光的2倍。 创建阈值张力蒙版的选择（编辑>选择>创建）（图4A7）。 将所选掩模转移到步骤5.4中生成的张力图像上，并测量打开探头的集成强度（ROI管理器 > 选择 （张力掩模）> 分析 > 测量 > RawIntDen）（图4C）。 从 RICM 掩模（ROI 管理器>选择（RICM 掩模）>应用掩模>分析>测量）测量细胞形态学属性面积、圆度和长宽比（图 4B）。 通过选择张力掩模图像并应用RICM掩模（ROI管理器 > 选择 （RICM掩模）> 分析 > 测量 > %面积）来测量机械破裂密度，定义为破裂探头的细胞足迹百分比（图4C）。 将测量值导出以进一步分析和可视化到统计软件中。 对每个单元格重复 5.1-5.11。