I disturbi mitocondriali (MD) sono un gruppo di sindromi multisistemiche causate da una compromissione delle funzioni mitocondriali a causa di mutazioni nel DNA¹ nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA). Sono tra le malattie metaboliche ereditarie più comuni, con una prevalenza di 1:5.000. Le malattie associate al mtDNA seguono le regole della genetica mitocondriale: ereditarietà materna, eteroplasmia ed effetto soglia e segregazione mitotica². Il mtDNA umano è un cerchio di DNA a doppio filamento di 16,6 kb, che contiene una breve regione di controllo con sequenze necessarie per la replicazione e la trascrizione, 13 geni codificanti proteine (tutte le subunità della catena respiratoria), 22 tRNA e 2 geni rRNA³.

Negli individui sani, esiste un singolo genotipo di mtDNA (omoplasmia), mentre più di un genotipo coesiste (eteroplasmia) in condizioni patologiche. Le mutazioni eteroplasmatiche deleterie devono superare una soglia critica per interrompere OXPHOS e causare malattie che possono colpire qualsiasi organo a qualsiasi età^{di 4} anni. La duplice genetica di OXPHOS determina la trasmissione: autosomica recessiva o dominante e legata all’X per le mutazioni del nDNA, materna per le mutazioni del mtDNA, più casi sporadici sia per nDNA che per mtDNA.

All’inizio dell’era della medicina mitocondriale, un esperimento storico di King e Attardi⁵ ha stabilito le basi per comprendere l’origine di una mutazione responsabile di una MD creando cellule ibride contenenti nuclei da linee cellulari tumorali in cui il mtDNA era completamente impoverito (cellule rho⁰) e mitocondri da pazienti con MD. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) non erano disponibili in quel momento, e non è stato facile determinare se una mutazione fosse presente nel genoma nucleare o mitocondriale. Il metodo, descritto nel 1989, è stato poi utilizzato da diversi ricercatori che lavorano nel campo della medicina mitocondriale 6,7,8,9; un protocollo dettagliato è stato recentemente pubblicato¹⁰, ma nessun video è stato ancora realizzato. Perché un tale protocollo dovrebbe essere rilevante al giorno d’oggi quando NGS potrebbe identificare in modo preciso e rapido dove si trova una mutazione? La risposta è che la generazione di cibridi è ancora il protocollo all’avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del mtDNA, correlare la percentuale di eteroplasmia con la gravità della malattia ed eseguire un’indagine biochimica in un sistema nucleare omogeneo in cui il contributo del background nucleare autoctono del paziente è assente^{11, 12,13}.

Questo protocollo descrive come ottenere citoplasti da fibroblasti confluenti derivati dal paziente coltivati in piastre di Petri da 35 mm. La centrifugazione delle piastre in presenza di citocalasina B consente l’isolamento di citoplasti enucleati, che vengono poi fusi con cellule rho⁰ in presenza di polietilenglicole (PEG). I cibridi risultanti vengono quindi coltivati in mezzo selettivo fino a quando non sorgono cloni. La sezione dei risultati rappresentativi mostra un esempio di caratterizzazione molecolare dei cibridi risultanti per dimostrare che il mtDNA è identico a quello dei fibroblasti dei pazienti donatori e che l’nDNA è identico al DNA nucleare della linea cellulare tumorale rho⁰ .