En in vitro-metod för att studera mitokondriell dysfunktion: En cybridmodell
Summary
Transmitochondriala cybrider är hybridceller erhållna genom att smälta mitokondriellt DNA (mtDNA) -utarmade celler (rho0-celler ) med cytoplaster (enukleerade celler) härrörande från patienter som drabbats av mitokondriella störningar. De möjliggör bestämning av sjukdomens nukleära eller mitokondriella ursprung, utvärdering av biokemisk aktivitet och bekräftelse av den patogenetiska rollen hos mtDNA-relaterade varianter.
Abstract
Brist på mitokondriella andningskedjekomplex som utför oxidativ fosforylering (OXPHOS) är den biokemiska markören för humana mitokondriella störningar. Ur genetisk synvinkel representerar OXPHOS ett unikt exempel eftersom det härrör från komplementeringen av två distinkta genetiska system: kärn-DNA (nDNA) och mitokondriellt DNA (mtDNA). Därför kan OXPHOS-defekter bero på mutationer som påverkar kärn- och mitokondriella kodade gener.
Det banbrytande arbetet av King och Attardi, som publicerades 1989, visade att mänskliga cellinjer utarmade av mtDNA (kallad rho0) kunde återbefolkas av exogena mitokondrier för att erhålla de så kallade “transmitochondriala cybriderna”. Tack vare dessa cybrider som innehåller mitokondrier härrörande från patienter med mitokondriella störningar (MD) och kärnor från rho0-celler är det möjligt att verifiera om en defekt är mtDNA- eller nDNA-relaterad. Dessa cybrider är också ett kraftfullt verktyg för att validera patogeniciteten hos en mutation och studera dess inverkan på biokemisk nivå. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll som beskriver cybridgenerering, urval och karakterisering.
Introduction
Mitokondriella störningar (MD) är en grupp multisystemsyndrom som orsakas av en försämring av mitokondriella funktioner på grund av mutationer i antingen nukleärt (nDNA) eller mitokondriellt (mtDNA) DNA1. De är bland de vanligaste ärftliga metaboliska sjukdomarna, med en prevalens på 1: 5000. mtDNA-associerade sjukdomar följer reglerna för mitokondriell genetik: moderns arv, heteroplasma och tröskeleffekt och mitotisk segregering2. Humant mtDNA är en dubbelsträngad DNA-cirkel på 16,6 kb, som innehåller en kort kontrollregion med sekvenser som behövs för replikation och transkription, 13 proteinkodande gener (alla subenheter i andningskedjan), 22 tRNA och 2 rRNA-gener3.
Hos friska individer finns det en enda mtDNA-genotyp (homoplasi), medan mer än en genotyp samexisterar (heteroplasmi) vid patologiska tillstånd. Skadliga heteroplasmatiska mutationer måste övervinna en kritisk tröskel för att störa OXPHOS och orsaka sjukdomar som kan påverka alla organ vid alla åldrar4. Oxphos dubbla genetik dikterar arv: autosomalt recessivt eller dominerande och X-länkat för nDNA-mutationer, moder för mtDNA-mutationer, plus sporadiska fall både för nDNA och mtDNA.
I början av mitokondriell medicin era, ett landmärke experiment av King och Attardi5 etablerade grunden för att förstå ursprunget till en mutation som är ansvarig för en MD genom att skapa hybridceller som innehåller kärnor från tumörcellinjer där mtDNA var helt utarmat (rho0-celler) och mitokondrier från patienter med MD. Nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) var inte tillgängliga vid den tiden, och det var inte lätt att avgöra om en mutation var närvarande i kärn- eller mitokondriellt genom. Metoden, som beskrevs 1989, användes sedan av flera forskare som arbetar inom mitokondriell medicin 6,7,8,9; ett detaljerat protokoll har nyligen publicerats10, men ingen video har gjorts ännu. Varför skulle ett sådant protokoll vara relevant idag när NGS exakt och snabbt kunde identifiera var en mutation finns? Svaret är att cybridgenerering fortfarande är det senaste protokollet för att förstå den patogena rollen hos någon ny mtDNA-mutation, korrelera andelen heteroplasmi med svårighetsgraden av sjukdomen och utföra en biokemisk undersökning i ett homogent kärnsystem där bidraget från patientens autoktona kärnbakgrund är frånvarande11, 12,13.
Detta protokoll beskriver hur man erhåller cytoplaster från sammanflytande, patienthärledda fibroblaster odlade i 35 mm petriskålar. Centrifugering av diskarna i närvaro av cytokalasin B möjliggör isolering av enukleerade cytoplaster, vilka sedan smälts med rho0-celler i närvaro av polyetylenglykol (PEG). De resulterande cybriderna odlas sedan i selektivt medium tills kloner uppstår. Det representativa resultatavsnittet visar ett exempel på molekylär karakterisering av de resulterande cybriderna för att bevisa att mtDNA är identiskt med det hos givarpatienternas fibroblaster och att nDNA är identiskt med kärn-DNA i tumöral rho 0-cellinjen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MtDNA har en mycket hög mutationshastighet jämfört med nDNA på grund av bristen på skyddande histoner och dess placering nära andningskedjan, vilket utsätter molekylen för skadliga oxidativa effekter som inte effektivt motverkas av reparationssystemen16. De första patogena mtDNA-mutationerna identifierades 198817,18, och sedan dess har ett stort antal mutationer beskrivits. NGS-teknik är ett relevant tillvägagångssätt för att…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie genomfördes i Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), finansierad av Mariani Foundation. VT är medlem i det europeiska referensnätverket för sällsynta neuromuskulära sjukdomar (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
