Un enfoque in vitro para estudiar la disfunción mitocondrial: un modelo cibrido
Summary
Los cibridos transmitocondiales son células híbridas obtenidas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial (ADNmt) (células rho0 ) con citólogos (células enucleadas) derivadas de pacientes afectados por trastornos mitocondriales. Permiten la determinación del origen nuclear o mitocondrial de la enfermedad, la evaluación de la actividad bioquímica y la confirmación del papel patogénico de las variantes relacionadas con el ADNmt.
Abstract
La deficiencia de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial que llevan a cabo la fosforilación oxidativa (OXPHOS) es el marcador bioquímico de los trastornos mitocondriales humanos. Desde un punto de vista genético, el OXPHOS representa un ejemplo único porque resulta de la complementación de dos sistemas genéticos distintos: el ADN nuclear (nDNA) y el ADN mitocondrial (ADNmt). Por lo tanto, los defectos de OXPHOS pueden deberse a mutaciones que afectan a genes codificados nucleares y mitocondriales.
El trabajo innovador de King y Attardi, publicado en 1989, mostró que las líneas celulares humanas agotadas de ADNmt (llamadas rho0) podrían ser repobladas por mitocondrias exógenas para obtener los llamados “cibridas transmitocondriales”. Gracias a estos cibridos que contienen mitocondrias derivadas de pacientes con trastornos mitocondriales (DM) y núcleos de células rho0 , es posible verificar si un defecto está relacionado con el ADNmt o el ADNm. Estos cibridos también son una poderosa herramienta para validar la patogenicidad de una mutación y estudiar su impacto a nivel bioquímico. Este artículo presenta un protocolo detallado que describe la generación, selección y caracterización de cibridas.
Introduction
Los trastornos mitocondriales (DM) son un grupo de síndromes multisistémicos causados por un deterioro en las funciones mitocondriales debido a mutaciones en el ADN nuclear (nDNA) o mitocondrial (ADNmt)1. Se encuentran entre las enfermedades metabólicas hereditarias más comunes, con una prevalencia de 1:5.000. Las enfermedades asociadas al ADNmt siguen las reglas de la genética mitocondrial: herencia materna, heteroplasmia y efecto umbral, y segregación mitótica2. El ADNmt humano es un círculo de ADN de doble cadena de 16,6 kb, que contiene una región de control corta con secuencias necesarias para la replicación y transcripción, 13 genes codificantes de proteínas (todas las subunidades de la cadena respiratoria), 22 ARNt y 2 genes de ARNr3.
En individuos sanos, hay un solo genotipo de ADNmt (homoplasmia), mientras que coexiste más de un genotipo (heteroplasmia) en condiciones patológicas. Las mutaciones heteroplásmicas perjudiciales deben superar un umbral crítico para interrumpir OXPHOS y causar enfermedades que pueden afectar a cualquier órgano a cualquier edad4 años. La genética dual de OXPHOS dicta la herencia: autosómica recesiva o dominante y ligada al cromosoma X para las mutaciones del ADNn, materna para las mutaciones del ADNmt, además de casos esporádicos tanto para el ADNmt como para el ADNmt.
Al comienzo de la era de la medicina mitocondrial, un experimento histórico de King y Attardi5 estableció la base para comprender el origen de una mutación responsable de un MD mediante la creación de células híbridas que contienen núcleos de líneas celulares tumorales en las que el ADNmt estaba completamente agotado (células rho0) y mitocondrias de pacientes con DM. Las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) no estaban disponibles en ese momento, y no fue fácil determinar si una mutación estaba presente en el genoma nuclear o mitocondrial. El método, descrito en 1989, fue utilizado por varios investigadores que trabajaban en el campo de la medicina mitocondrial 6,7,8,9; recientemente se ha publicado un protocolo detallado10, pero aún no se ha realizado ningún video. ¿Por qué un protocolo de este tipo debería ser relevante hoy en día cuando NGS podría identificar con precisión y rapidez dónde se encuentra una mutación? La respuesta es que la generación de cíbridos sigue siendo el protocolo de última generación para comprender el papel patogénico de cualquier nueva mutación de ADNmt, correlacionar el porcentaje de heteroplasmia con la gravedad de la enfermedad y realizar una investigación bioquímica en un sistema nuclear homogéneo en el que la contribución del fondo nuclear autóctono del paciente está ausente11, 12,13.
Este protocolo describe cómo obtener citoplastos a partir de fibroblastos confluentes derivados del paciente cultivados en placas de Petri de 35 mm. La centrifugación de los platos en presencia de citocalasina B permite el aislamiento de citoplastos enucleados, que luego se fusionan con células rho0 en presencia de polietilenglicol (PEG). Los cibridos resultantes se cultivan en medio selectivo hasta que surgen los clones. La sección de resultados representativos muestra un ejemplo de caracterización molecular de los cibridos resultantes para demostrar que el ADNmt es idéntico al de los fibroblastos de los pacientes donantes y que el ADNn es idéntico al ADN nuclear de la línea celular tumoral rho0 .
Protocol
Representative Results
Discussion
El ADNmt tiene una tasa de mutación muy alta en comparación con el ADNnm debido a la falta de histonas protectoras y su ubicación cerca de la cadena respiratoria, lo que expone a la molécula a efectos oxidativos dañinos no contrarrestados eficientemente por los sistemas de reparación16. Las primeras mutaciones patógenas del ADNmt se identificaron en 1988 17,18, y desde entonces, se han descrito un gran número de mutaciones. La tecn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio se llevó a cabo en el Centro para el Estudio de las Enfermedades Pediátricas Mitocondriales (http://www.mitopedia.org), financiado por la Fundación Mariani. VT es miembro de la Red Europea de Referencia para Enfermedades Neuromusculares Raras (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
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