Подход in vitro к изучению митохондриальной дисфункции: модель Cybrid
Summary
Транспамохондриальные цибриды представляют собой гибридные клетки, полученные путем слияния митохондриальной ДНК (мтДНК)-истощенных клеток (rho0 клеток) с цитопластами (энуклеированными клетками), полученными от пациентов, страдающих митохондриальными нарушениями. Они позволяют определить ядерное или митохондриальное происхождение заболевания, оценить биохимическую активность и подтвердить патогенетическую роль вариантов, связанных с мтДНК.
Abstract
Дефицит комплексов митохондриальной дыхательной цепи, осуществляющих окислительное фосфорилирование (OXPHOS), является биохимическим маркером митохондриальных нарушений человека. С генетической точки зрения OXPHOS представляет собой уникальный пример, потому что он является результатом дополнения двух различных генетических систем: ядерной ДНК (нДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК). Таким образом, дефекты OXPHOS могут быть вызваны мутациями, влияющими на ядерные и митохондриальные кодированные гены.
Новаторская работа Кинга и Аттарди, опубликованная в 1989 году, показала, что клеточные линии человека, истощенные мтДНК (названные rho0), могут быть повторно заселены экзогенными митохондриями для получения так называемых «транспамохондриальных цибрид». Благодаря этим цибридам, содержащим митохондрии, полученные от пациентов с митохондриальными расстройствами (МД) и ядрами из клеток rho0 , можно проверить, связан ли дефект с мтДНК или нДНК. Эти цибриды также являются мощным инструментом для проверки патогенности мутации и изучения ее влияния на биохимическом уровне. В этой статье представлен подробный протокол, описывающий генерацию, отбор и характеристику цибрид.
Introduction
Митохондриальные расстройства (МД) представляют собой группу мультисистемных синдромов, вызванных нарушением митохондриальных функций из-за мутаций в ядерной (нДНК) или митохондриальной (мтДНК) ДНК1. Они являются одними из наиболее распространенных наследственных метаболических заболеваний, с распространенностью 1: 5000. мтДНК-ассоциированные заболевания следуют правилам митохондриальной генетики: материнское наследование, гетероплазма и пороговый эффект, митотическая сегрегация2. МтДНК человека представляет собой двухцепочечный круг ДНК размером 16,6 кб, который содержит короткую контрольную область с последовательностями, необходимыми для репликации и транскрипции, 13 генов, кодирующих белок (все субъединицы дыхательной цепи), 22 тРНК и 2 гена рРНК3.
У здоровых людей существует один единственный генотип мтДНК (гомоплазма), тогда как в патологических состояниях сосуществует более одного генотипа (гетероплазмы). Вредные гетероплазматические мутации должны преодолеть критический порог, чтобы нарушить OXPHOS и вызвать заболевания, которые могут поразить любой орган в любом возрасте4 лет. Двойная генетика OXPHOS диктует наследование: аутосомно-рецессивная или доминантная и X-сцепленная для мутаций нДНК, материнская для мутаций мтДНК, плюс спорадические случаи как для нДНК, так и для мтДНК.
В начале эры митохондриальной медицины знаковый эксперимент Кинга и Аттарди5 установил основу для понимания происхождения мутации, ответственной за MD, путем создания гибридных клеток, содержащих ядра из опухолевых клеточных линий, в которых мтДНК была полностью истощена (rho0 клеток) и митохондрий у пациентов с MD. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) в то время были недоступны. и было нелегко определить, присутствует ли мутация в ядерном или митохондриальном геноме. Метод, описанный в 1989 году, затем использовался несколькими исследователями, работающими в области митохондриальной медицины 6,7,8,9; подробный протокол был недавно опубликован10, но видео еще не было сделано. Почему такой протокол должен быть актуален в настоящее время, когда NGS может точно и быстро определить, где находится мутация? Ответ заключается в том, что генерация цибрид по-прежнему является современным протоколом для понимания патогенной роли любой новой мутации мтДНК, корреляции процента гетероплазмы с тяжестью заболевания и выполнения биохимического исследования в однородной ядерной системе, в которой вклад автохтонного ядерного фона пациента отсутствует11, 12,13.
Этот протокол описывает, как получить цитопласты из сливающихся фибробластов, полученных от пациента, выращенных в 35 мм чашках Петри. Центрифугирование посуды в присутствии цитохалазина В позволяет выделить энуклеированные цитопласты, которые затем сплавляются с rho0 клетками в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ). Полученные цибриды затем культивируются в селективной среде до тех пор, пока не появятся клоны. В разделе репрезентативных результатов приведен пример молекулярной характеристики полученных цибрид, чтобы доказать, что мтДНК идентична фибробластам пациентов-доноров и что нДНК идентична ядерной ДНК опухолевой клеточной линии rho0 .
Protocol
Representative Results
Discussion
МтДНК имеет очень высокую частоту мутаций по сравнению с нДНК из-за отсутствия защитных гистонов и ее расположения близко к дыхательной цепи, что подвергает молекулу повреждающим окислительным эффектам, не эффективно противодействуемым системами репарации16. Первые пато?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было проведено в Центре изучения митохондриальных педиатрических заболеваний (http://www.mitopedia.org), финансируемом Фондом Мариани. VT является членом Европейской референс-сети по редким нервно-мышечным заболеваниям (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
