En in vitro tilnærming for å studere mitokondrie dysfunksjon: En Cybrid-modell
Summary
Transmitochondrial cybrids er hybridceller oppnådd ved å fusjonere mitokondrie-DNA (mtDNA)-utarmede celler (rho0 celler) med cytoplaster (enucleated celler) avledet fra pasienter som er rammet av mitokondrieforstyrrelser. De tillater bestemmelse av sykdommens kjernefysiske eller mitokondrieopprinnelse, evaluering av biokjemisk aktivitet og bekreftelse av den patogenetiske rollen til mtDNA-relaterte varianter.
Abstract
Mangel på mitokondrie respiratoriske kjedekomplekser som utfører oksidativ fosforylering (OXPHOS) er den biokjemiske markøren for menneskelige mitokondriesykdommer. Fra et genetisk synspunkt representerer OXPHOS et unikt eksempel fordi det er et resultat av komplementering av to distinkte genetiske systemer: kjernefysisk DNA (nDNA) og mitokondrie-DNA (mtDNA). Derfor kan OXPHOS-defekter skyldes mutasjoner som påvirker kjernefysiske og mitokondriekodede gener.
Det banebrytende arbeidet til King og Attardi, publisert i 1989, viste at menneskelige cellelinjer utarmet av mtDNA (kalt rho0) kunne fylles opp av eksogene mitokondrier for å oppnå de såkalte “transmitochondrial cybrids”. Takket være disse cybridene som inneholder mitokondrier avledet fra pasienter med mitokondriesykdommer (MD) og kjerner fra rho0-celler , er det mulig å verifisere om en defekt er mtDNA- eller nDNA-relatert. Disse cybridene er også et kraftig verktøy for å validere patogenisiteten til en mutasjon og studere dens innvirkning på et biokjemisk nivå. Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll som beskriver cybridgenerering, -utvalg og -karakterisering.
Introduction
Mitokondriesykdommer (MD) er en gruppe multisystemsyndromer forårsaket av en svekkelse i mitokondriefunksjoner på grunn av mutasjoner i enten kjernefysisk (nDNA) eller mitokondrie (mtDNA) DNA1. De er blant de vanligste arvelige metabolske sykdommene, med en prevalens på 1:5,000. mtDNA-assosierte sykdommer følger reglene for mitokondriegenetikk: mors arv, heteroplasma og terskeleffekt, og mititotisk segregering2. Human mtDNA er en dobbeltstrenget DNA-sirkel på 16,6 kb, som inneholder en kort kontrollregion med sekvenser som trengs for replikasjon og transkripsjon, 13 proteinkodingsgener (alle underenheter av luftveiene), 22 tRNA og 2 rRNA-gener3.
Hos friske individer er det en enkelt mtDNA genotype (homoplasmy), mens mer enn en genotype sameksisterer (heteroplasma) i patologiske forhold. Skadelige heteroplasmatiske mutasjoner må overvinne en kritisk terskel for å forstyrre OXPHOS og forårsake sykdommer som kan påvirke ethvert organ i alle aldre4 år. Den doble genetikken til OXPHOS dikterer arv: autosomal recessiv eller dominerende og X-koblet for nDNA-mutasjoner, mors for mtDNA-mutasjoner, pluss sporadiske tilfeller både for nDNA og mtDNA.
I begynnelsen av mitokondriemedisin-epoken etablerte et landemerkeeksperiment av King og Attardi5 grunnlaget for å forstå opprinnelsen til en mutasjon som er ansvarlig for en MD ved å lage hybridceller som inneholder kjerner fra tumorcellelinjer der mtDNA var helt utarmet (rho0 celler) og mitokondrier fra pasienter med MDs. Neste generasjons sekvensering (NGS) teknikker var ikke tilgjengelige på den tiden, og det var ikke lett å avgjøre om en mutasjon var tilstede i det kjernefysiske eller mitokondriegenomet. Metoden, beskrevet i 1989, ble deretter brukt av flere forskere som jobbet innen mitokondriemedisin 6,7,8,9; en detaljert protokoll har nylig blitt publisert10, men ingen video er laget ennå. Hvorfor skal en slik protokoll være relevant i dag når NGS nøyaktig og raskt kan identifisere hvor en mutasjon befinner seg? Svaret er at cybridgenerasjonen fortsatt er den toppmoderne protokollen for å forstå den patogene rollen til enhver ny mtDNA-mutasjon, korrelere prosentandelen av heteroplasma med alvorlighetsgraden av sykdommen, og utføre en biokjemisk undersøkelse i et homogent atomsystem der bidraget fra pasientens autochthonous kjernefysiske bakgrunn er fraværende11, 12,13.
Denne protokollen beskriver hvordan du får cytoplaster fra konfluente, pasientavledede fibroblaster dyrket i 35 mm Petri-retter. Sentrifugering av oppvasken i nærvær av cytochalasin B tillater isolering av enukleerte cytoplaster, som deretter smeltes sammen med rho0 celler i nærvær av polyetylenglykol (PEG). De resulterende cybridene dyrkes deretter i selektivt medium til kloner oppstår. Den representative resultatseksjonen viser et eksempel på molekylær karakterisering av de resulterende cybridene for å bevise at mtDNA er identisk med donorpasientenes fibroblaster, og at nDNA er identisk med kjerne-DNA-et til tumoral rho 0-cellelinjen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MtDNA har en svært høy mutasjonsrate sammenlignet med nDNA på grunn av mangel på beskyttende histoner og dens plassering nær luftveiene, noe som utsetter molekylet for skadelige oksidative effekter som ikke effektivt motvirkes av reparasjonssystemene16. De første patogene mtDNA-mutasjonene ble identifisert i 1988 17,18, og siden da har et stort antall mutasjoner blitt beskrevet. NGS-teknologi er en relevant tilnærming for å screene…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble utført i Center for the Study of Mitokondrie Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), finansiert av Mariani Foundation. VT er medlem av European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
