माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो दृष्टिकोण: एक साइब्रिड मॉडल
Summary
ट्रांसमिटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) को फ्यूज करके प्राप्त हाइब्रिड कोशिकाएं हैं – माइटोकॉन्ड्रियल विकारों से प्रभावित रोगियों से प्राप्त साइटोप्लास्ट (यून्यूक्लिएटेड कोशिकाओं) के साथ समाप्त कोशिकाएं (rho0 कोशिकाएं)। वे बीमारी के परमाणु या माइटोकॉन्ड्रियल मूल के निर्धारण, जैव रासायनिक गतिविधि के मूल्यांकन, और एमटीडीएनए से संबंधित वेरिएंट की पैथोजेनेटिक भूमिका की पुष्टि की अनुमति देते हैं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला परिसरों की कमी जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) को पूरा करती है, मानव माइटोकॉन्ड्रियल विकारों का जैव रासायनिक मार्कर है। आनुवांशिक दृष्टिकोण से, OXPHOS एक अद्वितीय उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह दो अलग-अलग आनुवंशिक प्रणालियों के पूरक के परिणामस्वरूप होता है: परमाणु डीएनए (nDNA) और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA)। इसलिए, OXPHOS दोष परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल एन्कोडेड जीन को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्तन के कारण हो सकते हैं।
1989 में प्रकाशित किंग और अटार्डी द्वारा ग्राउंडब्रेकिंग काम से पता चला है कि एमटीडीएनए (जिसका नाम rho0 है) की समाप्त हो गई मानव सेल लाइनों को तथाकथित “ट्रांसमिटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स” प्राप्त करने के लिए बहिर्जात माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा पुन: स्थापित किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल विकारों (एमडी) और rho0 कोशिकाओं से नाभिक के साथ रोगियों से व्युत्पन्न माइटोकॉन्ड्रिया युक्त इन cybrids के लिए धन्यवाद, यह सत्यापित करना संभव है कि क्या कोई दोष mtDNA- या nDNA से संबंधित है। ये साइब्रिड्स एक उत्परिवर्तन की रोगजनकता को मान्य करने और जैव रासायनिक स्तर पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण भी हैं। यह पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो साइब्रिड पीढ़ी, चयन और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल विकार (एमडी) मल्टीसिस्टम सिंड्रोम का एक समूह है जो या तो परमाणु (एनडीएनए) या माइटोकॉन्ड्रियल (एमटीडीएनए) डीएनए 1 में उत्परिवर्तन के कारण माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों में हानि के कारण होताहै। वे 1: 5,000 के प्रसार के साथ, सबसे आम विरासत में मिली चयापचय बीमारियों में से एक हैं। mtDNA से संबंधित रोग माइटोकॉन्ड्रियल आनुवांशिकी के नियमों का पालन करते हैं: मातृ विरासत, हेटरोप्लाज्मी और थ्रेशोल्ड प्रभाव, और माइटोटिक अलगाव2। मानव mtDNA 16.6 KB का एक डबल-फंसे हुए डीएनए सर्कल है, जिसमें प्रतिकृति और प्रतिलेखन के लिए आवश्यक अनुक्रमों के साथ एक छोटा नियंत्रण क्षेत्र होता है, 13 प्रोटीन-कोडिंग जीन (श्वसन श्रृंखला के सभी सबयूनिट्स), 22 tRNA, और 2 rRNA जीन3।
स्वस्थ व्यक्तियों में, एक एकल एमटीडीएनए जीनोटाइप (होमोप्लाज्मी) होता है, जबकि एक से अधिक जीनोटाइप रोग संबंधी स्थितियों में सह-अस्तित्व (हेटरोप्लाज्मी) होता है। हानिकारक हेटरोप्लाज्मिक उत्परिवर्तन को OXPHOS को बाधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा को दूर करना चाहिए और उन बीमारियों का कारण बनना चाहिए जो किसी भी उम्रमें किसी भी अंग को प्रभावित कर सकते हैं। OXPHOS के दोहरे आनुवांशिकी विरासत को निर्देशित करते हैं: ऑटोसोमल रिसेसिव या प्रमुख और एनडीएनए उत्परिवर्तन के लिए एक्स-लिंक्ड, एमटीडीएनए उत्परिवर्तन के लिए मातृ, साथ ही एनडीएनए और एमटीडीएनए दोनों के लिए छिटपुट मामले।
माइटोकॉन्ड्रियल चिकित्सा युग की शुरुआत में, किंग और अटार्डी5 द्वारा किए गए एक ऐतिहासिक प्रयोग ने ट्यूमर सेल लाइनों से नाभिक युक्त हाइब्रिड कोशिकाओं का निर्माण करके एमडी के लिए जिम्मेदार उत्परिवर्तन की उत्पत्ति को समझने के लिए आधार स्थापित किया, जिसमें एमटीडीएनए पूरी तरह से समाप्त हो गया था (rho0 कोशिकाएं) और एमडी वाले रोगियों से माइटोकॉन्ड्रिया। अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (NGS) तकनीकउस समय उपलब्ध नहीं थी, और यह निर्धारित करना आसान नहीं था कि परमाणु या माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में उत्परिवर्तन मौजूद था या नहीं। 1989 में वर्णित विधि, तब माइटोकॉन्ड्रियल चिकित्सा 6,7,8,9 के क्षेत्र में काम करने वाले कई शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग की गई थी; एक विस्तृत प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया है10, लेकिन कोई वीडियो अभी तक नहीं बनाया गया है. इस तरह के प्रोटोकॉल को आजकल प्रासंगिक क्यों होना चाहिए जब एनजीएस ठीक और तेजी से पहचान सकता है कि उत्परिवर्तन कहां स्थित है? जवाब यह है कि साइब्रिड पीढ़ी अभी भी किसी भी उपन्यास एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की रोगजनक भूमिका को समझने के लिए अत्याधुनिक प्रोटोकॉल है, जो बीमारी की गंभीरता के साथ हेटरोप्लाज्मी के प्रतिशत को सहसंबंधित करती है, और एक सजातीय परमाणु प्रणाली में एक जैव रासायनिक जांच करती है जिसमें रोगी की ऑटोक्थोनस परमाणु पृष्ठभूमि का योगदान अनुपस्थित है11, 12,13.
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में उगाए गए कॉन्फ्लुएंट, रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट से साइटोप्लास्ट कैसे प्राप्त किया जाए। साइटोकैलासिन बी की उपस्थिति में व्यंजनों का सेंट्रीफ्यूजेशन एन्यूक्लिएटेड साइटोप्लास्ट के अलगाव की अनुमति देता है, जो तब पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी) की उपस्थिति में rho0 कोशिकाओं के साथ जुड़े होते हैं। परिणामी cybrids तो चयनात्मक माध्यम में खेती कर रहे हैं जब तक क्लोन उत्पन्न होता है. प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग परिणाम cybrids के आणविक लक्षण वर्णन का एक उदाहरण दिखाता है यह साबित करने के लिए कि mtDNA दाता रोगियों के fibroblasts के समान है और nDNA ट्यूमरल rho0 सेल लाइन के परमाणु डीएनए के समान है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमटीडीएनए में सुरक्षात्मक हिस्टोन की कमी और श्वसन श्रृंखला के करीब इसके स्थान के कारण एनडीएनए की तुलना में बहुत अधिक उत्परिवर्तन दर होती है, जो अणु को ऑक्सीडेटिव प्रभावों को नुकसान पहुंचाने के लिए उज?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल बाल रोगों के अध्ययन के लिए केंद्र (http://www.mitopedia.org) में किया गया था, जिसे मारियानी फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था। वीटी दुर्लभ न्यूरोमस्कुलर रोगों (ईआरएन यूरो-एनएमडी) के लिए यूरोपीय संदर्भ नेटवर्क का एक सदस्य है।
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
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