Ein In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Dysfunktion: Ein Cybrid-Modell
Summary
Transmitochondriale Cybride sind Hybridzellen, die durch Verschmelzung von mitochondrialen DNA (mtDNA)-deplementierten Zellen (rho0-Zellen ) mit Zytoplasten (enukleierten Zellen) von Patienten mit mitochondrialen Störungen erhalten werden. Sie ermöglichen die Bestimmung des nuklearen oder mitochondrialen Ursprungs der Krankheit, die Bewertung der biochemischen Aktivität und die Bestätigung der pathogenetischen Rolle von mtDNA-bezogenen Varianten.
Abstract
Der Mangel an den mitochondrialen Atmungskettenkomplexen, die eine oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) durchführen, ist der biochemische Marker für mitochondriale Erkrankungen beim Menschen. Aus genetischer Sicht stellt der OXPHOS ein einzigartiges Beispiel dar, da er aus der Komplementarität zweier unterschiedlicher genetischer Systeme resultiert: Kern-DNA (nDNA) und mitochondrialer DNA (mtDNA). Daher können OXPHOS-Defekte auf Mutationen zurückzuführen sein, die nukleäre und mitochondriale kodierte Gene betreffen.
Die bahnbrechende Arbeit von King und Attardi, die 1989 veröffentlicht wurde, zeigte, dass menschliche Zelllinien, die von mtDNA (genannt Rho0) erschöpft waren, von exogenen Mitochondrien wieder besiedelt werden konnten, um die sogenannten “transmitochondrialen Cybrids” zu erhalten. Dank dieser Cybriden, die Mitochondrien enthalten, die von Patienten mit mitochondrialen Störungen (MDs) und Kernen ausRho-0-Zellen stammen, kann überprüft werden, ob ein Defekt mtDNA- oder nDNA-bezogen ist. Diese Cybriden sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Pathogenität einer Mutation zu validieren und ihre Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen. Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll, das die Generierung, Auswahl und Charakterisierung von Cybrid beschreibt.
Introduction
Mitochondriale Störungen (MDs) sind eine Gruppe von Multisystemsyndromen, die durch eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen aufgrund von Mutationen entweder in der Kern- (nDNA) oder der mitochondrialen (mtDNA) DNA1 verursacht werden. Sie gehören mit einer Prävalenz von 1:5.000 zu den häufigsten vererbten Stoffwechselerkrankungen. mtDNA-assoziierte Erkrankungen folgen den Regeln der mitochondrialen Genetik: mütterliche Vererbung, Heteroplasmie und Schwelleneffekt sowie mitotische Segregation2. Human mtDNA ist ein doppelsträngiger DNA-Kreis von 16,6 kb, der eine kurze Kontrollregion mit Sequenzen enthält, die für die Replikation und Transkription benötigt werden, 13 proteinkodierende Gene (alle Untereinheiten der Atmungskette), 22 tRNA und 2 rRNA-Gene3.
Bei gesunden Personen gibt es einen einzigen mtDNA-Genotyp (Homoplasmatik), während mehr als ein Genotyp unter pathologischen Zuständen koexistiert (Heteroplasmie). Schädliche heteroplasmatische Mutationen müssen eine kritische Schwelle überwinden, um OXPHOS zu stören und Krankheiten zu verursachen, die jedes Organ in jedem Alterbetreffen können 4. Die duale Genetik von OXPHOS diktiert die Vererbung: autosomal-rezessiv oder dominant und X-chromosomal für nDNA-Mutationen, mütterlich für mtDNA-Mutationen sowie sporadische Fälle sowohl für nDNA als auch für mtDNA.
Zu Beginn der Ära der mitochondrialen Medizin schuf ein bahnbrechendes Experiment von King und Attardi5 die Grundlage, um den Ursprung einer Mutation zu verstehen, die für einen MD verantwortlich ist, indem Hybridzellen geschaffen wurden, die Kerne aus Tumorzelllinien enthielten, in denen mtDNA vollständig erschöpft war (rho 0-Zellen) und Mitochondrien von Patienten mit MDs. Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht verfügbar. Und es war nicht einfach festzustellen, ob eine Mutation im nuklearen oder mitochondrialen Genom vorhanden war. Die 1989 beschriebene Methode wurde dann von mehreren Forschern verwendet, die auf dem Gebiet der mitochondrialen Medizin arbeiteten 6,7,8,9; Ein detailliertes Protokoll wurde kürzlichveröffentlicht 10, aber es wurde noch kein Video gemacht. Warum sollte ein solches Protokoll heutzutage relevant sein, wenn NGS genau und schnell identifizieren könnte, wo sich eine Mutation befindet? Die Antwort ist, dass die Cybrid-Erzeugung immer noch das State-of-the-Art-Protokoll ist, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mtDNA-Mutation zu verstehen, den Prozentsatz der Heteroplasmie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren und eine biochemische Untersuchung in einem homogenen Kernsystem durchzuführen, in dem der Beitrag des autochthonen nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt11, 12,13
Dieses Protokoll beschreibt, wie man Zytoplasten aus konfluierenden, von Patienten abgeleiteten Fibroblasten erhält, die in 35-mm-Petrischalen gezüchtet werden. Die Zentrifugation der Schalen in Gegenwart von Cytochalasin B ermöglicht die Isolierung von enukleierten Zytoplasten, die dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) mit Rho-0-Zellen verschmolzen werden. Die resultierenden Cybriden werden dann in selektivem Medium kultiviert, bis Klone entstehen. Der Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” zeigt ein Beispiel für die molekulare Charakterisierung der resultierenden Cybrids, um zu beweisen, dass die mtDNA mit der der Fibroblasten der Spenderpatienten identisch ist und dass die nDNA mit der Kern-DNA der tumoralenRho-0-Zelllinie identisch ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mtDNA hat eine sehr hohe Mutationsrate im Vergleich zu nDNA aufgrund des Mangels an schützenden Histonen und ihrer Lage in der Nähe der Atmungskette, die das Molekül schädlichen oxidativen Effekten aussetzt, denen die Reparatursysteme nicht wirksam entgegenwirken16. Die ersten pathogenen mtDNA-Mutationen wurden1988 identifiziert 17,18, und seitdem wurde eine große Anzahl von Mutationen beschrieben. Die NGS-Technologie ist ein rele…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde im Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org) durchgeführt, das von der Mariani Foundation finanziert wird. VT ist Mitglied des European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
