Transmitokondrielle cybrider er hybridceller opnået ved at fusionere mitokondrie-DNA (mtDNA)-udtømte celler (rho0-celler ) med cytoplaster (enukleerede celler) afledt af patienter, der er ramt af mitokondrieforstyrrelser. De tillader bestemmelse af sygdommens nukleare eller mitokondrielle oprindelse, evaluering af biokemisk aktivitet og bekræftelse af den patogenetiske rolle af mtDNA-relaterede varianter.
Mangel på mitokondrielle respiratoriske kædekomplekser, der udfører oxidativ phosphorylering (OXPHOS), er den biokemiske markør for humane mitokondrielle lidelser. Fra et genetisk synspunkt repræsenterer OXPHOS et unikt eksempel, fordi det skyldes komplementering af to forskellige genetiske systemer: nukleart DNA (nDNA) og mitokondrie-DNA (mtDNA). Derfor kan OXPHOS-defekter skyldes mutationer, der påvirker nukleare og mitokondrielle kodede gener.
Det banebrydende arbejde af King og Attardi, der blev offentliggjort i 1989, viste, at menneskelige cellelinjer udtømt for mtDNA (kaldet rho0) kunne genbefolkes af eksogene mitokondrier for at opnå de såkaldte “transmitokondrielle cybrider”. Takket være disse cybrider, der indeholder mitokondrier afledt af patienter med mitokondrielle lidelser (MD’er) og kerner fra rho0-celler , er det muligt at kontrollere, om en defekt er mtDNA- eller nDNA-relateret. Disse cybrider er også et kraftfuldt værktøj til at validere patogeniciteten af en mutation og studere dens indvirkning på et biokemisk niveau. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol, der beskriver cybridgenerering, udvælgelse og karakterisering.
Mitokondrielle lidelser (MD’er) er en gruppe af multisystemsyndromer forårsaget af en svækkelse i mitokondrielle funktioner på grund af mutationer i enten nukleart (nDNA) eller mitokondrielt (mtDNA) DNA1. De er blandt de mest almindelige arvelige metaboliske sygdomme med en forekomst på 1:5.000. mtDNA-associerede sygdomme følger reglerne for mitokondriel genetik: moderens arv, heteroplasmi og tærskeleffekt og mitotisk adskillelse2. Humant mtDNA er en dobbeltstrenget DNA-cirkel på 16,6 kb, som indeholder en kort kontrolregion med sekvenser, der er nødvendige for replikation og transkription, 13 proteinkodende gener (alle underenheder i åndedrætskæden), 22 tRNA og 2 rRNA-gener3.
Hos raske individer er der en enkelt mtDNA-genotype (homoplasmi), mens mere end en genotype sameksisterer (heteroplasmi) under patologiske tilstande. Skadelige heteroplasmatiske mutationer skal overvinde en kritisk tærskel for at forstyrre OXPHOS og forårsage sygdomme, der kan påvirke ethvert organ i enhver alderaf 4 år. Den dobbelte genetik af OXPHOS dikterer arv: autosomal recessiv eller dominerende og X-bundet til nDNA-mutationer, moderlig for mtDNA-mutationer plus sporadiske tilfælde både for nDNA og mtDNA.
I begyndelsen af mitokondriemedicinens æra etablerede et skelsættende eksperiment af King og Attardi5 grundlaget for at forstå oprindelsen af en mutation, der er ansvarlig for en MD ved at skabe hybridceller indeholdende kerner fra tumorcellelinjer, hvor mtDNA var helt udtømt (rho0-celler) og mitokondrier fra patienter med MD’er. Næste generations sekventeringsteknikker (NGS) var ikke tilgængelige på det tidspunkt, og det var ikke let at afgøre, om en mutation var til stede i det nukleare eller mitokondrielle genom. Metoden, der blev beskrevet i 1989, blev derefter brugt af flere forskere, der arbejdede inden for mitokondriemedicin 6,7,8,9; en detaljeret protokol er for nylig blevet offentliggjort10, men der er endnu ikke lavet nogen video. Hvorfor skulle en sådan protokol være relevant i dag, når NGS præcist og hurtigt kunne identificere, hvor en mutation er placeret? Svaret er, at cybridgenerering stadig er den nyeste protokol til at forstå den patogene rolle af enhver ny mtDNA-mutation, korrelere procentdelen af heteroplasma med sygdommens sværhedsgrad og udføre en biokemisk undersøgelse i et homogent nukleart system, hvor bidraget fra patientens autoktone nukleare baggrund er fraværende11, 12,13.
Denne protokol beskriver, hvordan man opnår cytoplaster fra sammenflydende, patientafledte fibroblaster dyrket i 35 mm petriskåle. Centrifugering af opvasken i nærvær af cytochalasin B tillader isolering af enukleerede cytoplaster, som derefter smeltes sammen med rho0-celler i nærvær af polyethylenglycol (PEG). De resulterende cybrider dyrkes derefter i selektivt medium, indtil kloner opstår. Afsnittet om repræsentative resultater viser et eksempel på molekylær karakterisering af de resulterende cybrider for at bevise, at mtDNA’et er identisk med donorpatienternes fibroblaster, og at nDNA’et er identisk med det nukleare DNA i den tumorale rho 0-cellelinje.
mtDNA har en meget høj mutationshastighed sammenlignet med nDNA på grund af manglen på beskyttende histoner og dets placering tæt på åndedrætskæden, hvilket udsætter molekylet for skadelige oxidative virkninger, der ikke effektivt modvirkes af reparationssystemerne16. De første patogene mtDNA-mutationer blev identificeret i 198817,18, og siden da er et stort antal mutationer blevet beskrevet. NGS-teknologi er en relevant tilgang …
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev udført i Center for Studiet af Mitokondrielle Pædiatriske Sygdomme (http://www.mitopedia.org), finansieret af Mariani Foundation. VT er medlem af European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
6 well Plates | Corning | 3516 | |
96 well Plates | Corning | 3596 | |
Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |