نهج في المختبر لدراسة خلل الميتوكوندريا: نموذج Cybrid
Summary
cybrids المتنقلة هي خلايا هجينة يتم الحصول عليها عن طريق دمج الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) – الخلايا المستنفدة (خلايا rho0 ) مع الخلايا الخلوية (الخلايا المنوحة) المشتقة من المرضى المصابين باضطرابات الميتوكوندريا. فهي تسمح بتحديد الأصل النووي أو الميتوكوندريا للمرض ، وتقييم النشاط الكيميائي الحيوي ، وتأكيد الدور الممرض للمتغيرات المرتبطة ب mtDNA.
Abstract
نقص مجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا التي تنفذ الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) هو العلامة الكيميائية الحيوية لاضطرابات الميتوكوندريا البشرية. من وجهة نظر وراثية ، يمثل OXPHOS مثالا فريدا لأنه ينتج عن استكمال نظامين وراثيين متميزين: الحمض النووي النووي (nDNA) والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). لذلك ، يمكن أن تكون عيوب OXPHOS ناتجة عن طفرات تؤثر على الجينات المشفرة النووية والميتوكوندريا.
أظهر العمل الرائد الذي قام به كينغ وأتاردي ، الذي نشر في عام 1989 ، أن خطوط الخلايا البشرية المستنفدة من mtDNA (المسماة rho0) يمكن إعادة توطينها بواسطة الميتوكوندريا الخارجية للحصول على ما يسمى ب “cybrids transmitochondrial”. بفضل هذه السيبريدات التي تحتوي على الميتوكوندريا المشتقة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) والنوى من خلايا rho0 ، من الممكن التحقق مما إذا كان العيب مرتبطا ب mtDNA أو nDNA. هذه السايبريدات هي أيضا أداة قوية للتحقق من صحة إمراض الطفرة ودراسة تأثيرها على المستوى الكيميائي الحيوي. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا يصف توليد السايبرد واختياره وتوصيفه.
Introduction
اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) هي مجموعة من المتلازمات متعددة الأنظمة الناجمة عن ضعف في وظائف الميتوكوندريا بسبب طفرات في الحمض النووي (nDNA) أو الميتوكوندريا (mtDNA)1. وهي من بين الأمراض الأيضية الموروثة الأكثر شيوعا ، مع انتشار 1: 5000. تتبع الأمراض المرتبطة ب mtDNA قواعد علم الوراثة الميتوكوندريا: وراثة الأم ، وتأثير الغيرية والعتبة ، والفصل الانقسامي2. mtDNA البشري هو دائرة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل من 16.6 كيلو بايت ، والتي تحتوي على منطقة تحكم قصيرة مع تسلسلات اللازمة للتكرار والنسخ ، و 13 جينا ترميز البروتين (جميع الوحدات الفرعية للسلسلة التنفسية) ، و 22 tRNA ، و 2 rRNA الجينات3.
في الأفراد الأصحاء ، هناك نمط وراثي واحد mtDNA (homoplasmy) ، في حين أن أكثر من نمط وراثي واحد يتعايش (heteroplasmy) في الحالات المرضية. يجب أن تتغلب الطفرات غير المتجانسة الضارة على عتبة حرجة لتعطيل OXPHOS والتسبب في أمراض يمكن أن تؤثر على أي عضو في أي عمر4. تملي الوراثة المزدوجة ل OXPHOS الميراث: صبغي جسدي متنحي أو مهيمن ومرتبط ب X لطفرات nDNA ، والأم لطفرات mtDNA ، بالإضافة إلى حالات متفرقة لكل من nDNA و mtDNA.
في بداية عصر طب الميتوكوندريا ، وضعت تجربة تاريخية أجراها كينغ وأتاردي5 الأساس لفهم أصل الطفرة المسؤولة عن MD عن طريق إنشاء خلايا هجينة تحتوي على نوى من خطوط الخلايا السرطانية التي تم فيها استنفاد mtDNA بالكامل (خلايا rho0) والميتوكوندريا من المرضى الذين يعانون من MDs. لم تكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) متاحة في ذلك الوقت ، ولم يكن من السهل تحديد ما إذا كانت هناك طفرة موجودة في الجينوم النووي أو الميتوكوندريا. ثم تم استخدام الطريقة ، الموصوفة في عام 1989 ، من قبل العديد من الباحثين العاملين في مجال طب الميتوكوندريا6،7،8،9. تم نشر بروتوكول مفصل مؤخرا10 ، ولكن لم يتم إنشاء أي فيديو حتى الآن. لماذا يجب أن يكون مثل هذا البروتوكول ذا صلة في الوقت الحاضر عندما يمكن ل NGS تحديد مكان وجود الطفرة بدقة وسرعة؟ الجواب هو أن توليد cybrid لا يزال البروتوكول الحديث لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في mtDNA ، وربط النسبة المئوية للتباين مع شدة المرض ، وإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس تكون فيه مساهمة الخلفية النووية الأصلية للمريض غائبة11 ، 12,13.
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على البلاستيدات الخلوية من الخلايا الليفية المتقاربة المشتقة من المريض والتي تزرع في أطباق بتري 35 ملم. يسمح الطرد المركزي للأطباق في وجود cytochalasin B بعزل الخلايا الخلوية المنوية ، والتي يتم دمجها بعد ذلك مع خلايا rho0 في وجود البولي إيثيلين جلايكول (PEG). ثم تزرع السيبريدات الناتجة في وسط انتقائي حتى تنشأ المستنسخات. يظهر قسم النتائج التمثيلية مثالا على التوصيف الجزيئي للسيبريدات الناتجة لإثبات أن mtDNA مطابق للخلايا الليفية للمرضى المتبرعين وأن nDNA مطابق للحمض النووي لخط خلية rho0 الوراثي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحتوي mtDNA على معدل طفرة مرتفع جدا مقارنة ب nDNA بسبب عدم وجود هيستون واقية وموقعه بالقرب من السلسلة التنفسية ، مما يعرض الجزيء لتأثيرات أكسدية ضارة لا تتصدى لها أنظمة الإصلاح بكفاءة16. تم تحديد أول طفرات mtDNA المسببة للأمراض في عام 1988 17,18 ، ومنذ ذلك الحين ، تم وصف …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجريت هذه الدراسة في مركز دراسة أمراض الميتوكوندريا لدى الأطفال (http://www.mitopedia.org)، بتمويل من مؤسسة مارياني. VT هي عضو في الشبكة المرجعية الأوروبية للأمراض العصبية العضلية النادرة (ERN EURO-NMD).
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T–>G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 – Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3′ hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer’s disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington’s disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
