미토콘드리아 기능 장애를 연구하기위한 체외 접근법 : Cybrid 모델
Summary
경미토콘드리아 사이브리드는 미토콘드리아 장애에 의해 영향을 받는 환자로부터 유래된 세포플라스트(enucleated cells)와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)-고갈 세포(rho0 cells)를 융합시켜 얻은 하이브리드 세포이다. 그들은 질병의 핵 또는 미토콘드리아 기원의 결정, 생화학 적 활성의 평가 및 mtDNA 관련 변이체의 병원성 역할의 확인을 허용합니다.
Abstract
산화적 인산화(OXPHOS)를 수행하는 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 결핍은 인간 미토콘드리아 장애의 생화학적 마커이다. 유전 적 관점에서 볼 때, OXPHOS는 핵 DNA (nDNA)와 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 두 가지 별개의 유전 시스템의 보완으로 인해 발생하기 때문에 독특한 예를 나타냅니다. 따라서, OXPHOS 결함은 핵 및 미토콘드리아 코딩된 유전자에 영향을 미치는 돌연변이에 기인할 수 있다.
1989년에 발표된 King과 Attardi의 획기적인 연구는 mtDNA가 고갈된 인간 세포주(rho0)가 외인성 미토콘드리아에 의해 재채워져 소위 “트랜스미토콘드리아 사이브리드”를 얻을 수 있음을 보여주었다. 미토콘드리아 장애 (MDs) 환자로부터 유래 된 미토콘드리아와 rho0 세포의 핵을 포함하는 이들 사이브리드 덕분에 결함이 mtDNA- 또는 nDNA와 관련이 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 사이브리드는 또한 돌연변이의 병원성을 검증하고 생화학 적 수준에서 그 영향을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 백서에서는 cybrid 생성, 선택 및 특성화를 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
미토콘드리아 장애 (MDs)는 핵 (nDNA) 또는 미토콘드리아 (mtDNA) DNA1의 돌연변이로 인한 미토콘드리아 기능의 손상으로 인한 다계통 증후군의 그룹입니다. 그들은 가장 흔한 유전 된 대사 질환 중 하나이며 1 : 5,000의 유병률이 있습니다. mtDNA 관련 질병은 미토콘드리아 유전학의 규칙을 따릅니다 : 모성 상속, 이종 혈질 및 역치 효과, 유사분열분리 2. 인간 mtDNA는 복제 및 전사에 필요한 서열, 13개의 단백질 코딩 유전자(호흡 사슬의 모든 서브유닛), 22개의 tRNA 및 2개의 rRNA 유전자를 갖는 짧은 조절 영역을 포함하는 16.6 kb의 이중 가닥 DNA원이다.
건강한 개체에는 하나의 단일 mtDNA 유전자형 (동종 플라스마)이 있지만 병리학 적 조건에서 하나 이상의 유전자형 (헤테로 플라스마)이 공존합니다. 해로운 이질성 돌연변이는 OXPHOS를 방해하고4 세에 모든 장기에 영향을 줄 수있는 질병을 일으키는 중요한 임계 값을 극복해야합니다. OXPHOS의 이중 유전학은 상속을 지시합니다 : 상염색체 열성 또는 우성 및 nDNA 돌연변이에 대한 X 연결, mtDNA 돌연변이에 대한 모성, nDNA 및 mtDNA 모두에 대한 산발적 인 경우.
미토콘드리아 의학 시대가 시작될 때, King과 Attardi5의 획기적인 실험은 mtDNA가 완전히 고갈된 종양 세포주(rho0 cells)와 MD 환자의 미토콘드리아로부터 핵을 포함하는 하이브리드 세포를 만들어 MD를 담당하는 돌연변이의 기원을 이해하는 기초를 확립했습니다. 돌연변이가 핵 또는 미토콘드리아 게놈에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 쉽지 않았습니다. 1989 년에 설명 된이 방법은 미 토콘드리아 의학 6,7,8,9 분야에서 일하는 여러 연구자들에 의해 사용되었습니다. 자세한 프로토콜은 최근10 번 게시되었지만 아직 비디오가 제작되지 않았습니다. NGS가 돌연변이가 어디에 있는지 정확하고 신속하게 식별 할 수있을 때 왜 그러한 프로토콜이 요즘 관련이 있어야합니까? 대답은 cybrid 생성이 여전히 새로운 mtDNA 돌연변이의 병원성 역할을 이해하고, 이종 형질의 비율을 질병의 중증도와 상관 관계시키고, 환자의 자가성 핵 배경의 기여가 결여되어있는 균질 핵 시스템에서 생화학 적 조사를 수행하는 최첨단 프로토콜이라는 것입니다11, 12,13년.
이 프로토콜은 35mm 페트리 접시에서 자란 합류성 환자 유래 섬유아세포로부터 세포플라스트를 얻는 방법을 기술한다. 시토칼라신 B의 존재하에 접시를 원심분리하면 enucleated cytoplasts의 분리가 가능하며, 이는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재하에 rho0 세포와 융합됩니다. 생성 된 cybrids는 클론이 발생할 때까지 선택적 배지에서 배양됩니다. 대표적인 결과 섹션은 mtDNA가 공여체 환자의 섬유아세포의 그것과 동일하고 nDNA가 종양 rho0 세포주의 핵 DNA와 동일하다는 것을 증명하기 위해 생성된 사이브라이드의 분자 특성화의 예를 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
mtDNA는 보호 히스톤의 부족 및 호흡 사슬에 가까운 그의 위치 때문에 nDNA에 비해 매우 높은 돌연변이율을 가지며, 이는 분자를 복구 시스템(16)에 의해 효율적으로 상쇄되지 않는 손상된 산화 효과에 노출시킨다. 최초의 병원성 mtDNA 돌연변이는 1988 년17,18 년에 확인되었으며, 그 이후로 많은 수의 돌연변이가 설명되었습니다. NGS 기술은 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Mariani Foundation이 자금을 지원하는 미토콘드리아 소아 질환 연구 센터 (http://www.mitopedia.org)에서 수행되었습니다. VT는 희귀 신경근 질환에 대한 유럽 참조 네트워크 (ERN EURO-NMD)의 회원입니다.
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Referências
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