Protokollen beskriver en modifikasjon av den raske Golgi-metoden, som kan tilpasses enhver del av nervesystemet, for farging av nevroner i hippocampus og medial prefrontal cortex av rotten.
Golgi impregnering, ved hjelp av Golgi farging kit med mindre tilpasninger, brukes til å impregnere dendritiske spines i rotte hippocampus og medial prefrontal cortex. Denne teknikken er en markert forbedring i forhold til tidligere metoder for Golgi impregnering fordi de forhåndsmiksede kjemikaliene er tryggere å bruke, nevroner er konsekvent godt impregnert, det er langt mindre bakgrunnsavfall, og for en gitt region er det ekstremt små avvik i ryggtetthet mellom eksperimenter. Videre kan hjerner akkumuleres etter et visst punkt og holdes frosset til videre behandling. Ved hjelp av denne metoden kan enhver hjerneregion av interesse studeres. Når farget og deksel gled, bestemmes dendritisk ryggtetthet ved å telle antall spines for en lengde av dendrit og uttrykt som ryggtetthet per 10 μm dendrit.
Metoden for å bruke kaliumdikromat og sølvnitrat for å merke nevroner ble først beskrevet av Camillo Golgi 1,2 og deretter brukt av Santiago Ramon y Cajal for å produsere en enorm kropp av arbeid som differensierer nevronale og gliale undertyper. En nylig utgitt bok med illustrasjonene hans er nå tilgjengelig3. Etter Ramon y Cajals studier, som ble publisert for mer enn 100 år siden, ble det brukt svært lite Golgi impregnering. Golgi impregnering er en arbeidskrevende prosess som tillater tredimensjonal visualisering av nevroner med et lysmikroskop. Det har vært mange modifikasjoner av Golgi-metoden gjennom årene for å gjøre metoden enklere og fargingen mer konsistent4. I 1984 beskrev Gabbott og Somogyi5 enkeltdelen Golgi impregneringsprosedyre som tillot raskere behandling. Denne Golgi impregneringsmetoden krever perfusjon med 4% paraformaldehyd og 1,5% picrinsyre, post-fiksering etterfulgt av vibratome seksjonering i et bad på 3% kaliumdikromat. Seksjoner er montert på glasssklier, de fire hjørnene av deksler limt slik at når de er nedsenket i sølvnitrat, blir diffusjon gradvis. Deksler poppes deretter av, seksjoner dehydreres, og til slutt dekselet glir permanent med monteringsmedium. Denne teknikken ble vellykket brukt til å merke nevroner og glia 6,7,8 i hippocampus. Den raske Golgi-metoden beskrevet her er en forbedring fordi det er langt mindre eksponering for både kaliumdikromat og sølvnitrat, og ingen paraformaldehyd og picrinsyre brukes. I tillegg, selv om celler som ble impregnert ved hjelp av modifikasjoner av Gabbott- og Somogyi5-metoden kunne analyseres, var ofte seksjonene over- eller undereksponerte eller falt av lysbildene under dehydreringstrinnet, og generelt måtte flere eksperimenter samles for å ha nok celler til analyse.
Den nåværende protokollen beskriver bruken av Golgi-fargesettet (se Tabell over materialer) for å merke dendritter og dendritiske spines i og medial prefrontal cortex (mPFC) av rotten. Fordelene med denne metoden over tidligere er at den er rask, det er mindre eksponering for skadelige kjemikalier for forskeren, og det er konsekvent farging av nevroner. Protokollen beskrevet nedenfor har blitt brukt med mindre modifikasjoner for å vurdere dendritisk ryggtetthet i hippocampus og mPFC av rotten i mange studier 9,10,11,12,13,14,15.
Den nåværende protokollen beskriver en metode for Golgi impregnering som muliggjør rask samtidig behandling av mange seksjoner. Det er en forbedring i forhold til tidligere beskrevne5 mer arbeidsintensive metoder og gir konsekvent impregnerte nevroner for analyse. I tillegg er det mindre eksponering for giftige kjemikalier som brukes i Golgi impregnering. Den mest utfordrende delen av prosessen er å få seksjonene til å være flate på lysbildene, noe som krever betydelig praksis. Å holde al…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |