Summary

Rask Golgi-flekk for dendrittisk ryggvisualisering i Hippocampus og Prefrontal Cortex

Published: December 03, 2021
doi:

Summary

Protokollen beskriver en modifikasjon av den raske Golgi-metoden, som kan tilpasses enhver del av nervesystemet, for farging av nevroner i hippocampus og medial prefrontal cortex av rotten.

Abstract

Golgi impregnering, ved hjelp av Golgi farging kit med mindre tilpasninger, brukes til å impregnere dendritiske spines i rotte hippocampus og medial prefrontal cortex. Denne teknikken er en markert forbedring i forhold til tidligere metoder for Golgi impregnering fordi de forhåndsmiksede kjemikaliene er tryggere å bruke, nevroner er konsekvent godt impregnert, det er langt mindre bakgrunnsavfall, og for en gitt region er det ekstremt små avvik i ryggtetthet mellom eksperimenter. Videre kan hjerner akkumuleres etter et visst punkt og holdes frosset til videre behandling. Ved hjelp av denne metoden kan enhver hjerneregion av interesse studeres. Når farget og deksel gled, bestemmes dendritisk ryggtetthet ved å telle antall spines for en lengde av dendrit og uttrykt som ryggtetthet per 10 μm dendrit.

Introduction

Metoden for å bruke kaliumdikromat og sølvnitrat for å merke nevroner ble først beskrevet av Camillo Golgi 1,2 og deretter brukt av Santiago Ramon y Cajal for å produsere en enorm kropp av arbeid som differensierer nevronale og gliale undertyper. En nylig utgitt bok med illustrasjonene hans er nå tilgjengelig3. Etter Ramon y Cajals studier, som ble publisert for mer enn 100 år siden, ble det brukt svært lite Golgi impregnering. Golgi impregnering er en arbeidskrevende prosess som tillater tredimensjonal visualisering av nevroner med et lysmikroskop. Det har vært mange modifikasjoner av Golgi-metoden gjennom årene for å gjøre metoden enklere og fargingen mer konsistent4. I 1984 beskrev Gabbott og Somogyi5 enkeltdelen Golgi impregneringsprosedyre som tillot raskere behandling. Denne Golgi impregneringsmetoden krever perfusjon med 4% paraformaldehyd og 1,5% picrinsyre, post-fiksering etterfulgt av vibratome seksjonering i et bad på 3% kaliumdikromat. Seksjoner er montert på glasssklier, de fire hjørnene av deksler limt slik at når de er nedsenket i sølvnitrat, blir diffusjon gradvis. Deksler poppes deretter av, seksjoner dehydreres, og til slutt dekselet glir permanent med monteringsmedium. Denne teknikken ble vellykket brukt til å merke nevroner og glia 6,7,8 i hippocampus. Den raske Golgi-metoden beskrevet her er en forbedring fordi det er langt mindre eksponering for både kaliumdikromat og sølvnitrat, og ingen paraformaldehyd og picrinsyre brukes. I tillegg, selv om celler som ble impregnert ved hjelp av modifikasjoner av Gabbott- og Somogyi5-metoden kunne analyseres, var ofte seksjonene over- eller undereksponerte eller falt av lysbildene under dehydreringstrinnet, og generelt måtte flere eksperimenter samles for å ha nok celler til analyse.

Den nåværende protokollen beskriver bruken av Golgi-fargesettet (se Tabell over materialer) for å merke dendritter og dendritiske spines i og medial prefrontal cortex (mPFC) av rotten. Fordelene med denne metoden over tidligere er at den er rask, det er mindre eksponering for skadelige kjemikalier for forskeren, og det er konsekvent farging av nevroner. Protokollen beskrevet nedenfor har blitt brukt med mindre modifikasjoner for å vurdere dendritisk ryggtetthet i hippocampus og mPFC av rotten i mange studier 9,10,11,12,13,14,15.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer er godkjent av Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee og er i samsvar med NIH Guide for omsorg og bruk av dyr. 1. Isolasjon og infiltrasjon av hjernevev Forblandingsløsninger A og B i Golgi-fargesettet 24 timer før bruk og oppbevare dem i mørke flasker og/eller i mørke. Lag ca. 80 ml oppløsning A og B-blanding som er tilstrekkelig til å endre oppløsningen etter 24 timer. Oppbevars i lufttette flasker…

Representative Results

Ved hjelp av den raske Golgi-metoden er cellene konsekvent godt impregnert slik at det er mange celler å analysere. Dette er en markant forbedring i forhold til tidligere metoder der eksperimenter måtte samles for å ha nok data til analyse. Derfor kan flere prøver behandles samtidig, og hjernen kan lagres frosset til behandling. Eksempler på Golgi impregnerte celler i CA1-regionen i hippocampus er vist ved lav og høy effekt i figur 3. Telling av spines i en gitt region gir konsistente …

Discussion

Den nåværende protokollen beskriver en metode for Golgi impregnering som muliggjør rask samtidig behandling av mange seksjoner. Det er en forbedring i forhold til tidligere beskrevne5 mer arbeidsintensive metoder og gir konsekvent impregnerte nevroner for analyse. I tillegg er det mindre eksponering for giftige kjemikalier som brukes i Golgi impregnering. Den mest utfordrende delen av prosessen er å få seksjonene til å være flate på lysbildene, noe som krever betydelig praksis. Å holde al…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.

Materials

Cardboard slides trays Fisher Scientific 12-587-10
Coverslips 24 x 60mm Fisher Scientific 12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit FD Neurotechnologies PK 401 Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray Fisher Scientific 23-022524
HISTO-CLEAR Fisher Scientific 50-899-90147 clearing agent
NCSS Software Kaysville, UT, USA
Permount Fisher Scientific SP-15-100 mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65 Used to mount brains on cryostat chuck

Referências

  1. Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
  2. Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
  3. Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
  4. Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
  5. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
  6. Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
  7. Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
  8. Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
  9. Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
  10. Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
  11. Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
  12. Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
  13. Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
  14. Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
  15. Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
  16. Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
  17. Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
  18. Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
  19. Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
  20. Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
  21. Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
  22. Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
check_url/pt/63404?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Frankfurt, M., Bowman, R. Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex. J. Vis. Exp. (178), e63404, doi:10.3791/63404 (2021).

View Video