En el presente protocolo, la técnica de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) se utiliza para determinar la distribución de la longitud de la cadena (CLD) y la longitud media de la cadena (ACL) del glucógeno.
Las partículas de glucógeno son polisacáridos ramificados compuestos por cadenas lineales de unidades de glucosilo unidas por enlaces glucósidos α-1,4. Estos últimos están unidos entre sí por enlaces glucósidos α-1,6, conocidos como puntos de ramificación. Entre las diferentes formas de almacenamiento de carbono (es decir, almidón, β-glucano), el glucógeno es probablemente uno de los polisacáridos de almacenamiento más antiguos y exitosos que se encuentran en todo el mundo vivo. Las cadenas de glucano están organizadas para que una gran cantidad de glucosa pueda almacenarse o alimentarse rápidamente en una célula cuando sea necesario. Numerosas técnicas complementarias se han desarrollado en las últimas décadas para resolver la estructura fina de las partículas de glucógeno. Este artículo describe la electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE). Este método cuantifica la población de cadenas de glucano que componen una partícula de glucógeno. También conocido como distribución de longitud de cadena (CLD), este parámetro refleja el tamaño de partícula y el porcentaje de ramificación. También es un requisito esencial para el modelado matemático de la biosíntesis de glucógeno.
El glucógeno, utilizado como almacenamiento de carbono y energía, es un homopolímero de glucosa que consiste en cadenas lineales de unidades glucosil unidas por (1 → 4)-enlaces α y unidas a través de (1 → 6)-α enlaces glicosídicos o puntos de ramificación. Aparecen como partículas β y α en el citosol de una amplia gama de organismos. β-partículas son pequeñas partículas solubles en agua observadas principalmente en procariotas. Su diámetro oscila entre 20-40 nm, probablemente dictado por las enzimas metabolizadoras de glucógeno y el obstáculo estérico 1,2.
Descritos por primera vez en células animales, las partículas α más grandes muestran hasta 300 nm de diámetro con una forma similar a la coliflor. Esta organización particular puede originarse a partir de la agregación de varias partículas β o puede surgir al surgir de una sola partícula β3. Curiosamente, un estudio reciente ha reportado la presencia de partículas de α en Escherichia coli4. Sin embargo, a diferencia de las partículas α de las células animales, estas últimas se desmoronan rápidamente durante el proceso de extracción, lo que puede explicar la falta de datos en la literatura4. La aparición de partículas de α en eucariotas y procariotas involucra enzimas metabolizadoras de glucógeno filogenéticamente no relacionadas5. Esto plantea preguntas sobre la función de tales partículas y la naturaleza de los posibles agentes de reticulación entre β partículas5.
Aunque se propusieron dos modelos matemáticos opuestos para la formaciónde moléculas de glucógeno 6,7,8,9, generalmente se acepta que las partículas de β han evolucionado en respuesta a su función metabólica como una reserva de combustible altamente eficiente para la liberación rápida de grandes cantidades de glucosa. Un gran cuerpo de evidencia indica que las propiedades del glucógeno, como la digestibilidad y la solubilidad en agua, se correlacionan con la longitud promedio de la cadena (LCA), que luego dictará el porcentaje de puntos de ramificación y el tamaño de partícula 2,6,7,8,10,11 . El LCA se define por la relación entre el número total de residuos de glucosa y el número de puntos de ramificación. Típicamente, los valores de LCA varían de 11-14 y 7-23 residuos de glucosa en eucariotas y procariotas, respectivamente10. En los seres humanos, varias enfermedades del trastorno del glucógeno se deben a la acumulación anormal de glucógeno. Por ejemplo, la enfermedad de Andersen se asocia con la actividad deficiente de una enzima ramificadora de glucógeno, lo que resulta en la acumulación de glucógeno anormal11. En procariotas, los estudios acumulativos sugieren que el LCA es un factor crítico que afecta la tasa de degradación del glucógeno y la capacidad de supervivencia bacteriana12,13. Se ha informado que las bacterias que sintetizan β partículas con un bajo valor de LCA se degradan más lentamente y, por lo tanto, resisten las condiciones de inanición por más tiempo. Por lo tanto, el conocimiento de la arquitectura de las partículas β es esencial para comprender la formación de partículas anormales de glucógeno en las enfermedades de almacenamiento de glucógeno humano y la supervivencia de los procariotas en un entorno deficiente en nutrientes.
Desde el primer aislamiento del glucógeno del hígado de perro por el fisiólogo francés Claude Bernard a finales del siglo XIX14, se desarrollaron muchas técnicas para caracterizar las partículas de glucógeno en detalle. Por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión para la morfología del glucógeno (partículas α o β)15, espectrometría protón-RMN para determinar el porcentaje de enlaces α-1,616, cromatografía de exclusión de tamaño con multidetectores para inferir el peso molecular, electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)17 o cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) tanto para la distribución de longitud de cadena (CLD) como para ACL determinación18.
Este trabajo se centra en el método de electroforesis de carbohidratos asistidos por fluoróforos, que se basa en la aminación reductora del grupo hemiacetal por función primaria de amina. Históricamente, el ácido trisulfónico 8-amino-1,3,6-naftaleno (ANTS) se utilizó por primera vez para el etiquetado. Más tarde, fue reemplazado por el fluoróforo más sensible, el ácido trisulfónico de pireno 8-amino 1,3,6 (APTS)19.
Figura 1: La reacción de aminación reductiva con ácido 8-amino 1,3,6 pireno trisulfónico (APTS). Reacción de aminación reductiva del grupo hemiacetal por función de amina primaria de ácido 8-amino 1,3,6 pireno trisulfónico (APTS) en condiciones reductivas Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se muestra en la Figura 1, la función hemiacetal del extremo reductor de una cadena de glucano interactúa con la amina primaria de APTS en condiciones reductoras. Los grupos sulfónicos de APTS llevan cargas negativas que permiten la separación de las cadenas de glucano según su grado de polimerización (DP). La reacción reductiva de la amina es altamente reproducible y eficiente. Se obtiene una eficiencia media de etiquetado del 80% para DP3 a DP135 y de hasta el 88% y el 97% para la maltosa (DP2) y la glucosa, respectivamente17,20. Debido a que una molécula de APTS reacciona con el extremo reductor de cada cadena de glucano, las cadenas individuales podrían cuantificarse y compararse entre sí sobre una base molar.
Las propiedades fisicoquímicas de las partículas de glucógeno (por ejemplo, tamaño, morfología, solubilidad) están directamente asociadas con la longitud de los glucanos que componen las partículas. Cualquier desequilibrio entre las enzimas biosintéticas y catabólicas resulta en la alteración de la distribución de la longitud de la cadena y , per se, la acumulación de glucógeno anormal que puede ser peligroso para la célula11. El análisis FACE es un método de elección para determinar la distribución de longitud de cadena (CLD) del glucógeno. Como se muestra en la Figura 2, la determinación de CLD permite la inferencia del valor promedio de longitud de cadena del glucógeno (ACL), que refleja la estructura de las partículas de glucógeno. Los glucógenos animales con altos valores de LCA se asocian con la aparición de partículas anormales. El análisis sustractivo es un método útil para comparar dos muestras de glucógeno de diferentes orígenes genéticos (mutante versus wildtype). Al trazar en una escala logarítmica los CLD normalizados al pico máximo, por otro lado, tiene la ventaja de comparar CLD independientemente de una referencia y nos dio información sobre el mecanismo de crecimiento del glucógeno.
Además, el análisis FACE es una técnica poderosa para caracterizar las propiedades catalíticas de las enzimas metabolizadoras de glucógeno. Por ejemplo, todas las enzimas ramificadas de glucógeno se escinden (1 → 4)-α enlaces y transfieren grupos oligomaltosiles a una posición (1 → 6)-α o puntos de ramificación. Las enzimas ramificadas son distinguibles debido a su afinidad por los polisacáridos (por ejemplo, amilopectina, glucógeno) y la longitud de los glucanos transferidos a pesar del mecanismo catalítico similar22. Por lo tanto, varias fuentes de enzimas ramificadas (humanas, vegetales, bacterias) se pueden caracterizar y clasificar a través de una serie de experimentos de incubación y comparaciones de CLD utilizando el análisis FACE23.
Como se mencionó en la introducción, HPAEC-PAD es también un método alternativo para determinar la distribución de la longitud de la cadena18. Ambas técnicas requieren la hidrólisis completa de (1 → 6)-α enlaces o puntos de ramificación mediante enzimas desramificantes de tipo isoamilasa antes de separar el pool de glucanos lineales según su grado de polimerización (DP). Sin embargo, el método HPAEC-PAD alberga dos desventajas en comparación con FACE: (1) la respuesta amperométrica del pulso disminuye a medida que aumentan las cadenas de glucano, lo que no proporciona información cuantitativa. Este problema de sesgo de masa se puede eludir utilizando HPAEC-ENZ-PAD que involucra un reactor enzimático posterior a la columna entre la columna de intercambio aniónico y PAD24. El reactor enzimático de columna hidroliza los malto-oligosacáridos en residuos de glucosa permitiendo una respuesta amperométrica de pulso constante. (2) El HPAEC-PAD permite la separación de cadenas de glucano con un grado de polimerización de hasta 70. Aunque la resolución es suficiente para determinar la EPC de las muestras de glucógeno, FACE separa las cadenas con DP de hasta 150, adecuado para muestras de almidón17. Es esencial tener en cuenta que tanto el análisis HPAEC-PAD como el FACE tienen pros y contras. Por ejemplo, la reacción de aminación requiere un grupo hemiacetal libre para reaccionar con la función de amina primaria del APTS. Esto implica que el etiquetado APTS no se puede utilizar para cadenas de glucano que carecen de extremos reductores (por ejemplo, inulina). El método HPAEC-PAD no requiere la presencia de extremos reductores. Un segundo aspecto interesante del método HPAEC-PAD es que la columna de intercambio aniónico se puede cargar con unos pocos miligramos de glucanos lineales, lo que permite la purificación de malto-oligosacárido con un DP específico o 14malto-oligosacárido radiomarcado C para ensayo enzimático 18,25. Finalmente, aunque la espectrometría de masas (por ejemplo, MALDI-TOF) es una técnica rápida y sensible para determinar la distribución de la longitud de la cadena, esta técnica parece ser menos reproducible. Sobreestima la cantidad de cadenas largas de glucano26. Sin embargo, este último se puede utilizar para una aplicación específica como las imágenes MALDI para mapear la presencia de glucógeno en el tejido celular27.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el CNRS, la Université de Lille CNRS y las becas ANR “MathTest” (ANR-18-CE13-0027).
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
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Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |