Mikrotubuliarkitekturen varierer meget på tværs af forskellige celletyper for at understøtte forskellige funktioner ^1,2. Dens dynamiske karakter af vækst og krympning muliggør hurtig tilpasning til ekstra- og intracellulære signaler og til at reagere på en celles stadigt skiftende behov. Derfor kan det betragtes som det “morfologiske fingeraftryk”, der spiller en nøglerolle i cellulær identitet.

Farmakologisk målretning af mikrotubuli cytoskelet ved hjælp af små molekylehæmmere har ført til en overflod af grundlæggende opdagelser inden for udviklingsbiologi, stamcellebiologi, kræftbiologi og neurobiologi 3,4,5,6,7. Selv om denne tilgang er uundværlig, frembyder den forskellige begrænsninger såsom toksicitet og virkninger uden for målgruppen. For eksempel er et af de mest anvendte mikrotubuli-målretningsmidler, nocodazol, et kraftigt mikrotubuli-depolymeriserende lægemiddel⁸. Imidlertid er småmolekylehæmmere såsom nocodazol aktive fra påføringstidspunktet, og i betragtning af mikrotubulicytoskelettets væsentlige karakter til mange kritiske cellulære funktioner kan global depolymerisering af mikrotubuli producere off-target-effekter, hvilket kan være uegnet til mange applikationer. Derudover er nocodazolbehandling irreversibel, medmindre prøver vaskes fri for lægemidlet, hvilket forhindrer kontinuerlig levende billeddannelse og dermed præcis sporing af individuelle mikrotubulifilamenter.

Udviklingen af lysaktiverede forbindelser begyndte med dannelsen af fotouncaged molekyler og har indvarslet en ny æra i målretning og overvågning af virkningerne af mikrotubuli væksthæmning på en præcis og rumligt kontrolleret måde. En familie af reversibelt fotoswitchbare lægemidler, fotostatiner (PST’er), blev udviklet ved at erstatte stilbenkomponenten i combretastatin A-4 med azobenzen⁹. PST’er er inaktive indtil belysning med UV-lys, hvorved den inaktive transkonfiguration konverteres til den aktive cis-konfiguration ved reversibel isomerisering. Cis-PST’er hæmmer mikrotubuli polymerisation ved at binde til colchicinbindingsstedet for β-tubulin, blokere dets grænseflade med β-tubulin og forhindre dimerisering, der kræves til mikrotubuli vækst¹⁰. Blandt en kohorte af PST’er er PST-1P opstået som en blyforbindelse, da den har den højeste styrke, er fuldt vandopløselig og viser en hurtig indtræden af bioaktivitet efter belysning.

Den mest effektive trans– til cis-isomerisering af PST’er forekommer ved bølgelængder mellem 360-420 nm, hvilket muliggør dobbelte muligheder for PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på et typisk konfokalmikroskop kan administreres for optimal rumlig målretning af mikrotubuli væksthæmning. Evnen til at lokalisere placeringen og timingen af PST-aktivering gennem 405 nm laserbelysning letter præcis tidsmæssig og rumlig kontrol, hvilket muliggør forstyrrelse af mikrotubulidynamikken på et subcellulært niveau inden for responstider på under et sekund⁹. Alternativt, en overkommelig LED UV-lys tillader hele organismen belysning at fremkalde organisme-bred forstyrrelse af mikrotubuli arkitektur. Dette kan være et omkostningseffektivt alternativ for forskere, for hvem den præcist timede indtræden af hæmning snarere end rumlig målretning er målet. Et andet træk ved PST’er er deres on-demand inaktivering ved at anvende grønt lys af en bølgelængde i området 510-540 nm⁹. Dette muliggør sporing af mikrotubulifilamenter før, under og efter PST-medieret væksthæmning.

PST’er, selvom de stadig er et relativt nyt design, er blevet brugt i adskillige in vitro-applikationer på tværs af forskellige forskningsområder¹¹, herunder undersøgelse af nye mekanismer for cellemigration i amøbeoider¹², i neuroner isoleret fra hjernen hos den nyfødte mus¹³ og udvikling af vingeepitel i Drosophila melanogaster¹⁴ . Andre lysreaktive lægemidler har vist sig at være værdifulde værktøjer til målrettet forstyrrelse af cellulær funktion. For eksempel blev en analog af blebbistatin, azidoblebbistatin, anvendt til forbedret myosinhæmning under belysning ^15,16. Dette fremhæver potentialet for nye opdagelser på grund af evnen til rumligt kontrolleret hæmning af cellulær funktion.

Levende 3D-organismer præsenterer fremragende, men mere sarte systemer til at manipulere mikrotubuli dynamik på et heldyrs-, enkeltcelle- eller subcellulært niveau under fysiologiske forhold. Især præimplantationsmusembryoet giver enestående indsigt i cellens indre arbejde såvel som intercellulære forhold i en organisme¹⁷. Tidsmæssigt og rumligt målrettede på hinanden følgende cyklusser af aktivering og deaktivering af PST’er bidrog til karakteriseringen af interfasebroen, en postcytokinetisk struktur mellem celler, som et ikke-centrosomalt mikrotubuliorganiserende center i præimplantationsmusembryoet¹⁶. En lignende forsøgsopstilling viste inddragelsen af voksende mikrotubuli i forseglingen af museembryoet for at muliggøre blastocystdannelse¹⁸. Desuden blev PST’er også anvendt i hele zebrafiskembryoner til at undersøge neuronal cellemigration ved at hæmme mikrotubuli vækst i en delmængde af celler i baghjernen¹⁹.

Denne protokol beskriver forsøgsopstillingen og anvendelsen af PST-1P i præimplantationsmusembryoet. Instruktionerne, der præsenteres her, kan også guide anvendelsen af PST’er til en lang række mål såsom undersøgelse af kromosomadskillelse og celledeling, handel med intracellulær last og cellemorfogenese og migration. Desuden vil sådanne undersøgelser hjælpe med implementeringen af PST’er i organoidsystemer, blastoider og andre embryomodeller såsom Caenorhabditis elegans og Xenopus laevis samt potentielt udvide brugen af PST’er til in vitro-befrugtningsteknologier .