Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu

Mikrotübül mimarisi, farklı işlevleri desteklemek için farklı hücre tipleri arasında büyük farklılıklar gösterir ^1,2. Büyüme ve büzülmenin dinamik doğası, hücre dışı ve hücre içi ipuçlarına hızlı adaptasyona ve bir hücrenin sürekli değişen ihtiyaçlarına cevap vermeye izin verir. Bu nedenle, hücresel kimlikte önemli bir rol oynayan “morfolojik parmak izi” olarak düşünülebilir.

Küçük molekül inhibitörleri kullanılarak mikrotübül sitoiskeletinin farmakolojik olarak hedeflenmesi, gelişim biyolojisi, kök hücre biyolojisi, kanser biyolojisi ve nörobiyolojide^çok sayıda temel keşfe yol açmıştır 3,4,5,6,7. Bu yaklaşım, vazgeçilmez olmakla birlikte, toksisite ve hedef dışı etkiler gibi çeşitli sınırlamalar sunar. Örneğin, en yaygın kullanılan mikrotübül hedefleme ajanlarından biri olan nokodazol, güçlü bir mikrotübül depolimerize edici ilaçtır⁸. Bununla birlikte, nokodazol gibi küçük moleküllü inhibitörler, uygulama anından itibaren aktiftir ve mikrotübül sitoiskeletinin birçok kritik hücresel fonksiyona temel doğası göz önüne alındığında, mikrotübüllerin küresel depolimerizasyonu, birçok uygulama için uygun olmayabilecek hedef dışı etkiler üretebilir. Ek olarak, nokodazol tedavisi, numuneler ilaçtan arındırılmadıkça, sürekli canlı görüntülemeyi önlemedikçe ve böylece bireysel mikrotübül filamentlerinin hassas bir şekilde izlenmesi sağlanmadıkça geri dönüşümsüzdür.

Işıkla aktive edilen bileşiklerin gelişimi, fotounklanmış moleküllerin yaratılmasıyla başladı ve mikrotübül büyüme inhibisyonunun etkilerini hassas ve mekansal olarak kontrol edilen bir şekilde hedefleme ve izlemede yeni bir çağın habercisi oldu. Geri dönüşümlü olarak foto-değiştirilebilir ilaçların bir ailesi olan fotostatinler (PST’ler), combretastatin A-4’ün stilben bileşeninin azobenzen⁹ ile değiştirilmesiyle geliştirilmiştir. PST’ler UV ışığı ile aydınlatılana kadar inaktiftir, böylece inaktif trans-konfigürasyon tersinir izomerizasyon ile aktif cis-konfigürasyonuna dönüşür. Cis-PST’ler, β-tübülinin kolşisin bağlanma bölgesine bağlanarak, β-tübülin ile arayüzünü bloke ederek ve mikrotübül büyümesi için gerekli dimerizasyonu önleyerek mikrotübül polimerizasyonunu inhibe eder¹⁰. Bir PST kohortu arasında, PST-1P, en yüksek potansiyele sahip olduğu, tamamen suda çözünür olduğu ve aydınlatmadan sonra hızlı bir biyoaktivite başlangıcı gösterdiği için bir kurşun bileşiği olarak ortaya çıkmıştır.

PST’lerin en etkili trans-cis-izomerizasyonu, 360-420 nm arasındaki dalga boylarında gerçekleşir ve bu da PST aktivasyonu için çift seçenek sağlar. Tipik bir konfokal mikroskop üzerinde 405 nm lazer çizgisi, mikrotübül büyüme inhibisyonunun optimal uzamsal hedeflemesi için uygulanabilir. PST aktivasyonunun yerini ve zamanlamasını 405 nm lazer aydınlatma ile belirleme yeteneği, hassas zamansal ve mekansal kontrolü kolaylaştırarak, mikrotübül dinamiklerinin hücre altı düzeyde, saniyenin altındaki tepki süreleri⁹ içinde bozulmasına izin verir. Alternatif olarak, uygun fiyatlı bir LED UV ışığı, tüm organizma aydınlatmasının mikrotübül mimarisinin organizma çapında bozulmasına neden olmasını sağlar. Bu, mekansal hedefleme yerine, tam olarak zamanlanmış inhibisyon başlangıcının hedef olduğu araştırmacılar için uygun maliyetli bir alternatif olabilir. PST’lerin bir diğer özelliği, 510-540 nm aralığında 9 dalga boyunda yeşil ışık uygulayarak isteğe bağlı^{inaktivasyonlarıdır}. Bu, PST aracılı büyüme inhibisyonu öncesinde, sırasında ve sonrasında mikrotübül filamentlerinin izlenmesini sağlar.

PST’ler, hala nispeten yeni bir tasarım olmasına rağmen, çeşitli araştırma alanlarında 11, amipoidlerde 12’de yeni hücre göçü mekanizmalarının araştırılması, yenidoğan farenin beyninden izole edilen nöronlarda¹³ ve Drosophila melanogaster’de kanat epitel gelişimi¹⁴ dahil olmak üzere çok sayıda in vitro uygulamada kullanılmıştır. . Diğer ışık reaktif ilaçların, hücresel fonksiyonun hedeflenen bozulmasında değerli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Örneğin, blebbistatinin bir analoğu olan azidoblebbistatin,^{aydınlatma 15,16} altında miyozin inhibisyonunu arttırmak için kullanılmıştır. Bu, hücresel fonksiyonun mekansal olarak zamansal olarak kontrol edilen inhibisyonu nedeniyle yeni keşifler potansiyelini vurgulamaktadır.

Canlı 3D organizmalar, fizyolojik koşullar altında tüm hayvan, tek hücreli veya hücre altı düzeyde mikrotübül dinamiklerini manipüle etmek için mükemmel ama daha hassas sistemler sunar. Özellikle, preimplantasyon fare embriyosu, hücrenin iç işleyişine ve bir organizma içindeki hücreler arası ilişkilere olağanüstü bir bakış açısı sunar¹⁷. PST’lerin zamansal ve mekansal olarak hedeflenmiş ardışık aktivasyon ve deaktivasyon döngüleri, preimplantasyon fare embriyosunda sentrozomal olmayan bir mikrotübül organizasyon merkezi olarak hücreler arasındaki post-sitokinetik bir yapı olan interfaz köprüsünün karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur¹⁶. Benzer bir deney düzeneği, blastosist oluşumuna izin vermek için fare embriyosunun sızdırmazlığına büyüyen mikrotübüllerin katılımını göstermiştir¹⁸. Ayrıca, PST’ler, arka beyin^19’daki hücrelerin bir alt kümesinde mikrotübül büyümesini inhibe ederek nöronal hücre göçünü araştırmak için tüm zebra balığı embriyolarında da kullanılmıştır.

Bu protokol, preimplantasyon fare embriyosunda PST-1P’nin deneysel kurulumunu ve kullanımını açıklar. Burada sunulan talimatlar ayrıca, kromozom ayrışması ve hücre bölünmesi, hücre içi kargo kaçakçılığı ve hücre morfogenezi ve göçü gibi çok çeşitli hedefler için PST’lerin uygulanmasına rehberlik edebilir. Ayrıca, bu tür çalışmalar PST’lerin organoid sistemlerde, blastoidlerde ve Caenorhabditis elegans ve Xenopus laevis gibi diğer embriyo modellerinde uygulanmasına yardımcı olacak ve ayrıca in vitro fertilizasyon teknolojileri için PST’lerin kullanımını potansiyel olarak genişletecektir.