L’architecture des microtubules varie considérablement selon les différents types de cellules pour prendre en charge diverses fonctions ^1,2. Sa nature dynamique de croissance et de rétrécissement permet une adaptation rapide aux signaux extra- et intracellulaires et de répondre aux besoins en constante évolution d’une cellule. Par conséquent, il peut être considéré comme « l’empreinte morphologique » jouant un rôle clé dans l’identité cellulaire.

Le ciblage pharmacologique du cytosquelette des microtubules à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules a conduit à une pléthore de découvertes fondamentales en biologie du développement, en biologie des cellules souches, en biologie du cancer et en neurobiologie ^3,4,5,6,7. Cette approche, bien qu’indispensable, présente diverses limites telles que la toxicité et les effets hors cible. Par exemple, l’un des agents ciblant les microtubules les plus utilisés, le nocodazole, est un puissant médicament dépolymérisant les microtubules⁸. Cependant, les inhibiteurs de petites molécules tels que le nocodazole sont actifs dès le moment de l’application et, compte tenu de la nature essentielle du cytosquelette de microtubules à de nombreuses fonctions cellulaires critiques, la dépolymérisation globale des microtubules peut produire des effets hors cible, ce qui peut ne pas convenir à de nombreuses applications. De plus, le traitement au nocodazole est irréversible à moins que les échantillons ne soient lavés sans médicament, ce qui empêche l’imagerie continue en direct et, par conséquent, le suivi précis des filaments de microtubules individuels.

Le développement de composés activés par la lumière a commencé avec la création de molécules photoconçues et a annoncé une nouvelle ère dans le ciblage et la surveillance des effets de l’inhibition de la croissance des microtubules de manière précise et contrôlée par spatiotemporalité. Une famille de médicaments photocommutables réversibles, les photostatines (PST), a été développée en remplaçant le composant stilbène de la combretastatine A-4 par de l’azobenzène⁹. Les PST sont inactifs jusqu’à l’éclairage par lumière UV, la trans-configuration inactive se convertissant en configuration cis active par isomérisation réversible. Les Cis-PST inhibent la polymérisation des microtubules en se liant au site de liaison à la colchicine de la β-tubuline, bloquant son interface avec la β-tubuline et empêchant la dimérisation nécessaire à la croissance des^{microtubules 10}. Parmi une cohorte de PST, le PST-1P est apparu comme un composé de plomb car il a la puissance la plus élevée, est entièrement soluble dans l’eau et montre un début rapide de bioactivité après l’illumination.

La trans– à cis-isomérisation la plus efficace des PST se produit à des longueurs d’onde comprises entre 360 et 420 nm, ce qui permet deux options pour l’activation PST. Une ligne laser de 405 nm sur un microscope confocal typique peut être administrée pour un ciblage spatial optimal de l’inhibition de la croissance des microtubules. La capacité de localiser l’emplacement et le moment de l’activation PST grâce à un éclairage laser de 405 nm facilite un contrôle temporel et spatial précis, permettant une perturbation de la dynamique des microtubules au niveau subcellulaire, dans des temps de réponse inférieurs à^{la seconde 9}. Alternativement, une lumière UV LED abordable permet à l’éclairage de l’organisme entier d’induire une perturbation de l’architecture des microtubules à l’échelle de l’organisme. Cela peut être une alternative rentable pour les chercheurs pour qui l’objectif est l’apparition précise de l’inhibition, plutôt que le ciblage spatial. Une autre caractéristique des PST est leur inactivation à la demande en appliquant la lumière verte d’une longueur d’onde comprise entre 510 et 540 nm⁹. Cela permet de tracer les filaments de microtubules avant, pendant et après l’inhibition de la croissance médiée par PST.

Les PST, bien qu’ils soient encore relativement récents, ont été utilisés dans de nombreuses applications in vitro dans divers domaines de recherche¹¹, y compris l’étude de nouveaux mécanismes de migration cellulaire dans les amiboïdes¹², dans les neurones isolés du cerveau de la souris nouveau-née¹³, et le développement de l’épithélium alaire chez Drosophila melanogaster¹⁴ . D’autres médicaments réactifs à la lumière se sont avérés être des outils précieux pour perturber de manière ciblée la fonction cellulaire. Par exemple, un analogue de la blébbistatine, l’azidoblébbistatine, a été utilisé pour améliorer l’inhibition de la myosine sous éclairage^15,16. Cela met en évidence le potentiel de nouvelles découvertes en raison de la capacité d’inhibition spatiotemporalement contrôlée de la fonction cellulaire.

Les organismes 3D vivants présentent des systèmes superbes mais plus délicats pour manipuler la dynamique des microtubules au niveau de l’animal entier, d’une seule cellule ou subcellulaire dans des conditions physiologiques. En particulier, l’embryon de souris préimplantatoire offre un aperçu exceptionnel du fonctionnement interne de la cellule ainsi que des relations intercellulaires au sein d’un organisme¹⁷. Des cycles consécutifs d’activation et de désactivation des PST ciblés temporellement et spatialement ont contribué à la caractérisation du pont interphasique, une structure post-cytocinétique entre les cellules, en tant que centre d’organisation de microtubules non centrosomiques dans l’embryon de souris préimplantatoire¹⁶. Une configuration expérimentale similaire a démontré l’implication de microtubules en croissance dans l’étanchéité de l’embryon de souris pour permettre la formation de blastocystes¹⁸. En outre, les PST ont également été utilisés dans des embryons entiers de poisson-zèbre pour étudier la migration des cellules neuronales en inhibant la croissance des microtubules dans un sous-ensemble de cellules du cerveau postérieur¹⁹.

Ce protocole décrit la configuration expérimentale et l’utilisation de PST-1P dans l’embryon de souris préimplantatoire. Les instructions présentées ici peuvent également guider l’application des PST pour un large éventail d’objectifs tels que l’étude de la ségrégation chromosomique et de la division cellulaire, le trafic de cargaison intracellulaire et la morphogenèse et la migration cellulaires. En outre, de telles études aideront à la mise en œuvre des PST dans les systèmes organoïdes, les blastoïdes et d’autres modèles embryonnaires tels que Caenorhabditis elegans et Xenopus laevis, ainsi qu’à étendre potentiellement l’utilisation des PST pour les technologies de fécondation in vitro .