フォトスタチンを用いた生きた着床前マウス胚における微小管細胞骨格の時空間的細胞内操作
Summary
基礎研究および応用研究で広く使用されている典型的な微小管阻害剤は、細胞に広範な影響を及ぼします。最近、フォトスタチンは、微小管の瞬間的、可逆的、時空間的に正確な操作が可能な光スイッチ可能な微小管阻害剤のクラスとして登場した。この段階的なプロトコルは、3Dライブ着床前マウス胚におけるフォトスタチンの適用を詳述する。
Abstract
微小管細胞骨格は、細胞のフレームワークを形成し、細胞内輸送、細胞分裂、およびシグナル伝達の基本である。例えば、ノコダゾールを用いたユビキタス微小管ネットワークの伝統的な薬理学的破壊は、あらゆる細胞に壊滅的な結果をもたらす可能性がある。可逆的に光交換可能な微小管阻害剤は、薬物効果を時空間的に制御された方法で実施することを可能にすることによって、限界を克服する可能性を秘めている。そのような薬物ファミリーの1つは、アゾベンゼンベースのフォトスタチン(PST)である。これらの化合物は暗所条件下では不活性であり、UV光で照明すると、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、微小管重合および動的ターンオーバーを遮断する。ここで、3次元(3D)ライブ着床前マウス胚におけるPSTの適用は、細胞内レベルで微小管ネットワークを破壊するように設定されている。このプロトコルは、実験セットアップの手順、および生細胞共焦点顕微鏡を使用したPSTの光活性化および不活性化パラメータを提供します。これにより、再現性が確保され、他の人がこの手順を研究課題に適用できるようになります。PSTのような革新的なフォトスイッチは、動的な細胞内微小管ネットワークの理解を促進し、リアルタイムで細胞骨格を非侵襲的に操作するための強力なツールとして進化する可能性があります。さらに、PSTは、オルガノイド、ブラストイド、または他の種の胚などの他の3D構造において有用であることが証明され得る。
Introduction
微小管アーキテクチャは、多様な機能をサポートするために、異なる細胞タイプ間で大きく異なる1,2。成長と収縮のそのダイナミックな性質は、細胞外および細胞内の手がかりへの迅速な適応を可能にし、細胞の絶え間なく変化するニーズに応えることを可能にする。したがって、それは細胞の同一性において重要な役割を果たす「形態学的指紋」と考えることができる。
小分子阻害剤を用いた微小管細胞骨格の薬理学的標的化は、発生生物学、幹細胞生物学、癌生物学、および神経生物学3、4、5、6、7における多数の基本的な発見をもたらしている。このアプローチは、不可欠ではありますが、毒性やオフターゲット効果など、さまざまな限界があります。例えば、最も広く使用されている微小管標的化剤の1つであるノコダゾールは、強力な微小管脱重合剤8である。しかしながら、ノコダゾールのような小分子阻害剤は、適用時から活性であり、微小管細胞骨格が多くの重要な細胞機能に必須の性質を有することを考えると、微小管のグローバルな解重合はオフターゲット効果を生じる可能性があり、これは多くの用途には適さない可能性がある。さらに、ノコダゾール処理は、サンプルを薬物なしで洗浄しない限り不可逆的であり、連続的なライブイメージング、したがって個々の微小管フィラメントの正確な追跡を妨げる。
光活性化化合物の開発は、光アンケージド分子の創製から始まり、微小管成長阻害の影響を正確かつ時空間的に制御された方法で標的化およびモニタリングする新しい時代を告げた。可逆的に光交換可能な薬物の1つのファミリーであるフォトスタチン(PST)は、コンブレタスタチンA-4のスチルベン成分をアゾベンゼン9で置き換えることによって開発された。PSTはUV光による照明まで不活性であり、それによって不活性 トランス配置は可逆的異性化によって活性 シス配置に変換される。 Cis-PSTsは、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、β-チューブリンとの界面を遮断し、微小管増殖に必要な二量体化を防止することによって微小管重合を阻害する10。PSTのコホートの中で、PST-1Pは、最も高い効力を有し、完全に水溶性であり、照明後に生理活性の急速な発症を示すため、鉛化合物として浮上している。
PSTの最も効果的な トランスから シス異性化は、360〜420nmの波長で起こり、PST活性化のための二重オプションを可能にする。典型的な共焦点顕微鏡上の405nmレーザーラインを投与して、微小管成長阻害の最適な空間ターゲティングを行うことができる。405nmレーザー照射によるPST活性化の位置とタイミングを正確に特定する機能は、正確な時間的および空間的制御を容易にし、1秒未満の応答時間内に細胞内レベルで微小管ダイナミクスの破壊を可能にします9。あるいは、手頃な価格のLED UV光は、生物全体の照明が微小管アーキテクチャの生物全体の破壊を誘発することを可能にする。これは、空間的ターゲティングではなく、正確にタイミングを合わせた阻害の開始が目標である研究者にとって、費用対効果の高い代替手段となる可能性があります。PSTのもう1つの特徴は、510〜540nmの範囲の波長の緑色光を印加することによってオンデマンドで不活性化されることです9。これにより、PST媒介性増殖阻害の前、最中、および後の微小管フィラメントのトレースが可能になります。
PSTsは、まだ比較的最近の設計ではあるが、アメーバイド12、新生児マウス13の脳から単離されたニューロンにおける細胞遊走の新しいメカニズムの調査、ショウジョウバエメラノガスター14における翼上皮の発生の調査を含む、多様な研究分野にわたる多数のin vitroアプリケーション11で使用されてきた。.他の光反応性薬物は、細胞機能の標的破壊において貴重なツールであることが証明されている。例えば、ブレビスタチンの類似体であるアジドブレビスタチンを、照明下でのミオシン阻害の増強に使用した15、16。これは、細胞機能の時空間的に制御された阻害の能力による新しい発見の可能性を強調している。
生きた3D生物は、生理学的条件下で動物全体、単一細胞、または細胞内レベルで微小管のダイナミクスを操作するための、優れた、より繊細なシステムを提示します。特に、着床前マウス胚は、細胞の内部の働きならびに生物内の細胞間関係についての例外的な洞察を提供する17。PSTの活性化および不活性化の時間的および空間的に標的化された連続的なサイクルは、着床前マウス胚16における非中心染色体微小管組織化中心としての、細胞間の細胞間運動学的構造である相間架橋の特性評価に寄与した。同様の実験セットアップは、胚盤胞形成を可能にするためにマウス胚のシーリングにおける微小管の成長の関与を実証した18。さらに、PSTsは、後脳内の細胞のサブセットにおける微小管増殖を阻害することによって神経細胞遊走を調べるために、ゼブラフィッシュ胚全体においても使用された19。
このプロトコルは、着床前マウス胚におけるPST-1Pの実験セットアップおよび使用を記載する。ここで提示された指示はまた、染色体の分離および細胞分裂の研究、細胞内貨物の輸送、ならびに細胞の形態形成および遊走の研究など、幅広い目的のためのPSTの適用を導くことができる。さらに、このような研究は、オルガノイド系、芽球状、および Caenorhabditis elegans および Xenopus laevisなどの他の胚モデルにおけるPSTの実装を支援し、 体外 受精技術のためのPSTの使用を拡大する可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小管ネットワークは、細胞の基本的な内部動作に不可欠です。その結果、ネットワークへのいかなる摂動も細胞機能のあらゆる側面に広範な結果をもたらす傾向があるため、これは生物における微小管ダイナミクスを操作する上で課題を提示する。光スイッチ可能な微小管標的化合物の出現は、微小管増殖阻害の誘導および逆転に対する優れた制御を用いて、細胞内レベルで細胞骨格を正?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、原稿作成に関するフォトスタチンとアドバイスを提供してくれたOliver Thorn-Seshold博士とLi Gao博士、撮影支援のためのMonash Production、顕微鏡検査支援のためのMonash Micro Imaging に感謝します。
この研究は、J.Z.への国家保健医療研究評議会(NHMRC)プロジェクト助成金APP2002507とJ.Z.へのカナダ高等研究所(CIFAR)アズリエリ奨学金によって支援されました。オーストラリア再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの助成金によって支援されています。
Materials
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides – LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes – 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch – Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice – wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes – Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
Referências
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