삼광자 현미경 검사는 마우스와 제브라피쉬 뇌와 같은 살아있는 생물학적 조직 깊숙한 곳에서 높은 시공간 분해능으로 고대비 형광 이미징을 가능하게 합니다.
2광자 현미경 (2PM) 및 3 광자 현미경 (3PM)과 같은 다중 광자 현미경 기술은 세포 내 해상도로 생체 내 심부 조직 이미징을위한 강력한 도구입니다. 3PM은 생물학 실험실에서 널리 사용 된 2PM 이상의 심부 조직 이미징에 대한 두 가지 주요 이점을 가지고 있습니다 : (i) ~ 1,300 nm 또는 ~ 1,700 nm 여기 레이저를 사용하여 산란 조직에서 더 긴 감쇠 길이; (ii) 고차 비선형 여기로 인한 배경 형광 생성 감소. 그 결과, 3PM은 피질층에서 해마, 성인 제브라피쉬의 전뇌 전체에 이르기까지 온전한 마우스 뇌와 같은 산란 조직 깊숙한 곳에서 고대비 구조 및 기능적 이미징을 허용합니다.
오늘날 3PM에 적합한 레이저 소스가 상용화되어 기존의 2P(2P) 이미징 시스템을 3광자(3P) 시스템으로 전환할 수 있습니다. 또한 여러 상업용 3P 현미경을 사용할 수 있으므로 생물학 연구소에서이 기술을 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 논문은 전형적인 3PM 설정, 특히 이미 2P 설정이있는 생물학 그룹을 대상으로하는 최적화를 보여 주며 손상되지 않은 마우스 및 성인 제브라 피쉬 뇌에서 생체 내 3D 이미징을 보여줍니다. 이 프로토콜은 현미경 정렬, ~ 1,300 및 ~ 1,700 nm 레이저 펄스의 프리 치핑, 동물 준비 및 성인 제브라 피쉬 및 마우스 두뇌 깊숙한 곳에서 중요한 3P 형광 이미징을 포함한 3P 이미징의 전체 실험 절차를 다룹니다.
생명 과학에서 2PM 및 3PM과 같은 다중 광자 현미경 (MPM) 기술은 높은 시공간 분해능과 산란 조직의 높은 대비로 심층적 인 생체 내 이미징을위한 강력한 도구였습니다. 또한, 이러한 방법은 1 광자 공초점 현미경1,2,3,4와 비교할 때 더 적은 광표백을 유발합니다. 3PM은 두 가지 주요 특징으로 인해 2PM과 비교할 때 더 깊은 조직 이미징에 유리합니다 : (i) 장파장 여기 (~ 1,300 nm 또는 ~ 1,700 nm)의 고용은 조직 산란을 감소시키고, (ii) 고차 여기 과정 (즉, 형광 신호는 원하지 않는 배경 형광을 억제하는 2PM의 여기 전력의 제곱 대신 3PM에서의 여기 전력의 입방체에 의존한다)3 . 결과적으로, 3PM은 손상되지 않은 성인 마우스 뇌 3,5,6,7,8,9,10,11의 해마와 같은 살아있는 조직의 더 깊은 영역과 Ca2+를 포함한 성인 제브라피쉬 12의 전뇌 전뇌에서 고대비 이미징을 가능하게합니다. 활동 기록 및 다색 관찰. 또한, 마우스와 성인 제브라피쉬12,13의 손상되지 않은 두개골을 통해 오후 3시로 고대비 이미지가 얻어졌습니다.
오늘날 ~1,300nm 및 ~1,700nm에서 3P 여기(3PE)에 적합한 여기 레이저 소스가 상용화되어 있습니다. 레이저 스캐닝 시스템은 2PM 및 3PM에 대해 본질적으로 동일하기 때문에, 기존의 2P 셋업을 3P 셋업으로 변환하는 것은 3PE용 상용화된 레이저의 설치와 함께 생물학 실험실에서 가능하다. 3P 형광 신호는 대물 렌즈의 레이저 전력, 펄스 지속 시간, 레이저 반복률 및 수치 조리개 (NA)에 따라 달라집니다. 회절-제한된 초점(즉, 대물 렌즈의 백 애퍼처가 여기 빔에 의해 오버필됨)을 가정하면, Eq(1)은 3PE로부터 생성된 초점 부피로부터의 시간-평균화된 형광 광자 플럭스를 기술한다.
(1)
여기서 f는 레이저 반복률이고, τ는 레이저 펄스 지속시간(반값에서 전폭), φ는 시스템 수집 효율이고, η는 형광 양자 효율이고, σ3은 3P 흡수 단면이고, C는 형광단 농도이고, n0은 샘플 매질(예를 들어, 물)의 반사 지수이고, λ는 진공에서의 여기 파장이고, NA는 대물 렌즈의 개구수이고, 3은 초점 볼륨의 공간 적분 상수이며, 대물 렌즈 아래의 시간 평균 여기 광자 플럭스(광자/s)이고, z는 이미지화된 깊이이고, EAL은 유효 감쇠 길이(14)이다. 여기서 우리는 EAL (전형적으> 100 μm)이 현미경의 축 분해능 (전형적으로 < 10 μm)보다 훨씬 크다고 가정하였다. 역축 근사치에서3은 28.114와 같습니다. gp(3)은 여기 소스의 3차수 시간적 일관성이고, gp(3)은 하이퍼볼릭-세컨트-제곱 펄스 및 가우시안 펄스에 대해 각각 0.41 및 0.51이다. φ 수집 효율은 대물렌즈에 의한 형광 수집, 대물렌즈의 투과율, 이색성 거울의 반사율, 필터의 투과율, 및 검출기(예를 들어, 광승수관, 또는 PMT)의 검출 효율을 고려하여 추정될 수 있다. 3P 형광 강도는 다양한 파라미터에 크게 의존하기 때문에 3P 형광 신호를 최대화하기 위해서는 3P 설정의 최적화가 필요합니다.
이 프로토콜은 일반적인 3P 설정의 최적화 프로세스를 보여 주며, 이는 특히 2P 설정을 가지고 있으며 3P 이미징으로 기능을 확장하거나 상용 3P 설정을 최적의 성능으로 유지하려는 생물학 실험실에 유용합니다. 이 비디오 기사는 또한 살아있는 동물의 두뇌에서 심부 조직 3P 이미징을 보여줍니다. 첫 번째 섹션에서는 상용 레이저 소스 및 다중 광자 현미경을 사용한 일반적인 3P 설정의 최적화에 대해 설명합니다. 두 번째 및 세 번째 섹션에서는 뉴런 구조 및 활동의 3PM에 대한 제브라 피쉬 및 마우스 준비에 대해 각각 설명합니다. 마우스 두개골 절제술은 이전에 프로토콜 논문 및 15,16,17에보고되었습니다. 네 번째 섹션은 제브라 피쉬와 마우스 뇌에서 생체 내 3P 이미징을 보여줍니다.
이 프로토콜은 상용 현미경 및 레이저 소스로 3P 이미징을 설정하는 단계별 절차를 설명합니다. 2PM에 비해, 3PM은 마우스 뇌 해마에서와 같이 더 깊은 영역에서의 광학 접근을 필요로 하는 어플리케이션에서 이점을 갖는다. 3PM은 주로 신경 과학에 사용되지만 3PM은 심부 조직 관찰을 위해 림프절, 뼈 및 종양과 같은 다른 조직에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.
이미징 시스템이 샷 노이즈 제한에 근접하여 수행되는지 확인하는 것이 중요하며, 이는 감지 및 데이터 수집 전자 장치가 PMT 후 이미지에 무시할 수 있는 노이즈를 기여하도록 보장합니다. 검출된 광자 수의 불확실성은 근본적으로 광자 샷 노이즈에 의해 제한된다. 샷-노이즈 제한 성능은 고이득 광검출기(예를 들어, PMT)를 사용하는 전형적인 다중 광자 현미경에서 달성될 수 있다. 광자 샷 노이즈는 푸아송 통계 분포를 따르며, 여기서 분포의 표준 편차는 분포 평균의 제곱근과 같습니다. 샷 노이즈 제한 성능을 확인하려면 프로토콜 섹션의 1.14단계를 따르십시오.
H2O에 의한 광 감쇠를 피하기 위해, 침지용으로D2O를 사용하는 것이 특히 ~1,700nm 여기의 경우 도움이 된다. D2O를 사용하는 경우 ~10분마다 D2O를 새로 고치거나 이미징 중에 D2O/H2O교환을 피하기 위해대량의D2O를사용해야 합니다. 하나는 또한 방 환경(3)으로부터D2O를 밀봉할 수 있다. 장거리 작동 거리(WD) 대물 렌즈(예: 4mm 이상의 WD)를 이미징에 사용하는 경우, 침지 액체 두께는 2-3mm를 초과할 수 있습니다. 증가 된 두께는 ~ 1,300 nm21에서도H2O 흡수를 무시할 수 없게 만듭니다. 따라서,D2O는 긴 WD 대물렌즈를 사용하는 경우 1,300 nm 3PM의 경우에도 필요할 수 있다.
3P 형광 강도는 초점에서의 여기 펄스 에너지의 큐브(Eq. (1))에 의존하기 때문에, 적절한 레이저 파워를 설정하는 것은 살아있는 조직에서 열적 및 비선형 손상을 피하면서 적절한 3P 형광 신호를 얻기 위해 특히 중요하다. 평균 레이저 전력은 열 손상 임계값 이하로 유지되어야 합니다. 예를 들어, 마우스 뇌에서, 열 조직 손상을 피하기 위해, 마우스 뇌 표면의 평균 전력은 1 mm 깊이에서 ~1,300 nm 여기 및 230 μm x 230 μm 21의 시야각(FOV)을 위해 ~100 mW 이하로 유지되어야 한다. 마찬가지로, ~1,700nm에서의 평균 전력은 ~1mm 깊이에서 ~50mW 이하로 유지되어야 하고, FOV는 ~230μm x 230μm(미공개 데이터)로 유지되어야 한다. 또한, 여기 포화 및 잠재적 비선형 손상을 피하기 위해, 여기 펄스 에너지는 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm 여기, 각각 30 내지 2 nJ 및 3 nJ로 유지되어야 한다.
조직의 광 흡수 및 산란으로 인해 초점의 펄스 에너지는 1 EAL에 의해 조직 침투 후 1 / e (~ 37 %)로 감쇠됩니다. EAL은 상이한 조직 및 여기 파장에 따라, 예를 들어, 마우스 뇌의 신피질에서, EAL은 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm에서 각각 ~300 μm 및 ~400 μm이고, 각각 3,29이다(도 5). 따라서, 동일한 펄스 에너지를 n개의 EAL의 깊이에서 초점(예를 들어, 1nJ/펄스)으로 유지하려면, 표면 펄스 에너지에 1nJ × en을 곱해야 한다. 구조적 및 기능적 역학의 빠른 이미징을 위해, 높은 반복률(1MHz 이상에서)을 갖는 여기 레이저가 높은 프레임 레이트5,6,7,10을 달성하는 것이 바람직하다. 그러나 펄스 에너지 요구 사항 및 평균 레이저 전력 제한은 적용 가능한 반복률을 제한합니다.
예를 들어, 4 EALs에서 적당히 깊은 영역을 이미지 할 때 (즉, 1,300 nm 여기가있는 마우스 피질에서 ~ 1.2 mm), 표면에서 ~ 55 nJ / 펄스가 1 nJ / 펄스의 초점을 유지해야합니다. 평균 전력 제한이 100mW인 경우 ~2MHz 레이저 반복률을 적용할 수 있습니다. 그러나 7 EAL의 깊이에서 더 깊이 이미지화하려면 초점에서 1 nJ / 펄스를 유지하기 위해 표면에서 ~ 1,100 nJ / 펄스가 필요합니다. 열 손상을 피하기 위해 최대 평균 전력이 100mW라고 가정하면 레이저 반복률을 0.1MHz로 줄여 표면에서 1,100nJ/펄스를 달성해야 합니다. 표 1은 마우스 뇌 피질에서의 전형적인 영상화 조건을 요약한 것이다. 표 1의 이미징 깊이는 EAL이 전체 마우스 피질에서 균일하다고 가정한다.
더욱이, 심부 조직 3PM에서의 레이저 전력 제한으로 인해, 프레임 레이트와 이미지 픽셀 크기 사이에 트레이드오프가 존재하며, 이는 칼슘 이미징과 같은 기능적 이미징에 특히 중요하다. 최대 가용 레이저 반복률은 초점에서 요구되는 펄스 에너지 및 위에서 논의된 바와 같이 적용 가능한 평균 레이저 전력, 예를 들어, 1,300nm 여기와 함께 ~4 EAL에 상응하는 깊이에서 2MHz에 기초하여 각 깊이에서 결정된다. 일반적으로 이미징에는 픽셀당 적어도 하나의 펄스가 필요합니다. 따라서, 최소 이용가능한 픽셀 체류 시간은 레이저 반복률, 예를 들어, 2MHz 여기를 갖는 0.5μs/픽셀에 의해 결정된다.
3P 이미지에서 높은 공간 해상도(측면 1μm)를 유지하려면 1픽셀을 ~1μm2의 영역, 예를 들어 250 x 250μm2의 FOV의 경우 256 x256픽셀로 설정하는 것이이상적입니다. 따라서, 상당히 큰 FOV로 빠른 이미징을 수행하기 위해(예를 들어, 250 x 250 μm2, 256 x256 픽셀), 0.5 MHz, 1 MHz 및 2 MHz 펄스 반복률은 각각 ~7.6, ~15 및 ~30 프레임/s의 이론적인 최대 프레임 레이트를 제공한다. 마찬가지로, 레이저 반복률의 최적화는 목표 깊이, 스캔 속도 및 FOV에 따라 열 손상 임계값 하에서 적절한 펄스 에너지를 적용하는 데 필수적입니다. 이미징 속도를 증가시키기 위해, 적응형 여기 소스가 뉴런(31)에 필요에 따라 레이저 펄스를 전달함으로써 뉴런(즉, 관심 영역) 상의 모든 여기 펄스를 집중시키는데 사용될 수 있다.
3PM은 마우스 뇌의 두개골, 뼈 및 백질층(즉, 외부 캡슐)과 같은 고도로 산란된 매질을 통해 그리고 살아있는 조직 내의 심층 영상화에서 2PM과 비교할 때 유리하다. EIL이 길수록 3PE의 고차 비선형 여기가 심부 조직 이미징에 도움이됩니다. 예를 들어, 마우스 피질에서 GCaMP6을 이미지화하기 위해, 920 nm 여기를 갖는 2P 형광 신호는 690 μm에서 얕은 영역에서 1,300 nm 여기를 갖는 3P 형광 신호보다 높다(즉, 1,300 nm에서 ∼2.3 EALs)21. 그러나, 920 nm에 비해 1,300 nm에서 더 긴 EEL로 인해, 3PE는 ~690 μm의 깊이에서 2P 여기(2PE)보다 더 강한 형광을 제공하고 21 더 깊은21에서 더 강한 형광을 제공한다. 이 깊이는 ‘신호 크로스오버 깊이’로 정의되며, 여기서 2PE 및 3PE의 형광 신호 강도는 동일한 반복률 및 동일한 최대 허용 평균 전력(21)과 동일하다. 신호 크로스오버 깊이는 2PE 및 3PE 및 형광단에 대한 여기 파장에 따라 달라집니다.
실제로, 920nm 여기는 더 적은 흡수로 인해 1,300nm 여기보다 더 높은 평균 레이저 파워를 허용합니다. 그러나 2PE의 평균 전력이 높을수록 신호 크로스 오버 깊이가 0.9 EALs4 만 푸시됩니다. 또한, 샘플이 조밀하게 라벨링될 때, 3PE는 훨씬 더 높은 SBR의 추가적인 이점을 갖는다. 따라서 신호 크로스 오버 길이에 도달하기 전에도 3PM은 2PM보다 이미징에 더 좋을 수 있습니다. 예를 들어, ~2%의 부피 분율(즉, 라벨링 밀도)을 갖는 마우스 뇌 혈관조직을 영상화할 때, 100 mW의 여기 파워를 갖는 1,300 nm 3PM은 플루오레세인에 대해 ∼700 μm의 깊이에서 200 mW의 여기 파워로 920 nm 2PM을 능가한다.
도 3PM은 얇지만 고도로 산란되는 층을 통해 이미징할 때 여기 빔의 포인트 확산 기능을 왜곡시키고 디포커스 배경(4)을 생성할 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 마우스 뇌의 무손상 두개골을 통해, 2PM 이미지는 뇌 표면(13)으로부터 <100 μm의 얕은 깊이에서도 디포커스 배경을 겪는다. 유사한 디포커스 배경이 2PM에서 마우스 뇌(32)에서 백질을 통한 1,280 nm 여기와 함께 관찰되었다. 따라서, 조직이 탁한 층을 통해 영상화되는 경우, 라벨링 밀도에 관계없이 고콘트라스트 이미징을 위해 3PM이 2PM보다 바람직하다.
우리는 최근에 비드 팬텀과 3PM의 이미징 깊이 한계가 8EALs 33 이상임을 보여주는 이론적 분석을보고했습니다. 8 EAL은 마우스 피질에서 ~ 1,700 nm 여기가있는 ~ 3 mm와 동일합니다. 그러나 현재 사용 가능한 레이저는 마우스 뇌에서 8 EAL을 달성하기에 충분한 펄스 에너지를 가지고 있지 않습니다. 더 강한 레이저의 추가 개발은 현재 3PM의 이미징 깊이 제한을 밀어 낼 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub 및 NIH 1U01NS103516이 지원했습니다.
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |