三光子显微镜能够以高时空分辨率在活生物组织(如小鼠和斑马鱼大脑)深处进行高对比度荧光成像。
多光子显微镜技术,如双光子显微镜(2PM)和三光子显微镜(3PM),是具有亚细胞分辨率的深部组织 体内 成像的强大工具。3PM对于在生物学实验室中广泛使用的2PM以上的深部组织成像具有两个主要优点:(i)通过采用~1,300 nm或~1,700 nm激发激光,在散射组织中具有更长的衰减长度;(ii)由于高阶非线性激发而产生的背景荧光较少。因此,3PM允许在散射组织(例如从皮质层到海马体和成年斑马鱼的整个前脑的完整小鼠大脑)的深处进行高对比度的结构和功能成像。
如今,适用于3PM的激光源已经上市,可以将现有的双光子(2P)成像系统转换为三光子(3P)系统。此外,还有多种商用3P显微镜可用,这使得该技术随时可供生物学研究实验室使用。本文展示了典型3PM设置的优化,特别是针对已经具有2P设置的生物学组,并展示了完整小鼠和成年斑马鱼大脑的活体3D成像。该协议涵盖了3P成像的完整实验过程,包括显微镜对准,〜1,300和〜1,700nm激光脉冲的预切,动物制备以及成年斑马鱼和小鼠大脑深处的活体3P荧光成像。
在生命科学中,多光子显微镜(MPM)技术(如2PM和3PM)已成为具有高时空分辨率和散射组织中高对比度的深部体内成像的强大工具。此外,与单光子共聚焦显微镜1,2,3,4相比,这些方法引起的光漂白较少。与2PM相比,3PM对于更深的组织成像是有利的,因为有两个主要特征:(i)采用更长波长的激发(~1,300 nm或~1,700 nm)减少组织散射,以及(ii)高阶激发过程(即荧光信号依赖于3PM激发功率的立方体,而不是2PM中激发功率的平方),抑制不需要的背景荧光3.因此,3PM可以在活组织中更深层区域进行高对比度成像,例如完整成年小鼠大脑3,5,6,7,8,9,10,11和成年斑马鱼12的整个前脑(包括Ca2 +)中的海马体 活动记录和多色观察。此外,通过小鼠和成年斑马鱼的完整头骨12,13获得了3PM的高对比度图像。
如今,适用于~1,300和~1,700 nm的3P激发(3PE)的激发激光源已上市。由于激光扫描系统对于2PM和3PM基本上是相同的,因此在生物学实验室中,通过安装市售的3PE激光器,可以将现有的2P设置转换为3P设置。3P荧光信号取决于物镜的激光功率、脉冲持续时间、激光重复率和数值孔径(NA)。假设衍射极限聚焦(即物镜的后孔径被激发光束过度填充),方程(1)描述了来自3PE产生的焦体积的时间平均荧光光子通量。
(1)
其中f是激光重复率,τ是激光脉冲持续时间(半最大值处的全宽),φ是系统收集效率,η是荧光量子效率,σ3是3P吸收截面,C是荧光团浓度,n0是样品介质(例如水)的反射指数,λ是真空中的激发波长, NA是物镜的数值孔径,a3是焦体积的空间积分常数,是物镜下的时间平均激发光子通量(光子/秒),z是成像深度,EAL是有效衰减长度14。在这里,我们假设EAL(通常>100μm)远大于显微镜的轴向分辨率(通常<10μm)。在半轴近似下,3 等于 28.114。gp(3) 是激发源的 3次时间相干,对于双曲正割平方脉冲和高斯脉冲,gp(3) 分别为 0.41 和 0.51。通过考虑物镜的荧光采集、物镜的透射率、二向色镜的反射率、滤光片的透射率以及检测器(例如,光电倍增管或PMT)的检测效率,可以估计φ的采集效率。由于3P荧光强度高度依赖于各种参数,因此需要优化3P设置以最大化3P荧光信号。
该协议说明了典型3P设置的优化过程,这对于具有2P设置并计划将其功能扩展到3P成像或保持其商业3P设置处于最佳性能的生物实验室尤其有用。这篇视频文章还演示了活体动物大脑中的深层组织3P成像。第一部分涉及使用市售激光源和多光子显微镜优化典型的3P设置。第二和第三部分分别描述了斑马鱼和小鼠的准备,用于3PM的神经元结构和活动。小鼠开颅手术以前在方案论文中也有15,16,17的报道。第四部分展示了斑马鱼和小鼠大脑中的活体3P成像。
该协议解释了使用商用显微镜和激光源设置3P成像的分步程序。与2PM相比,3PM在需要光学访问的更深层区域(如小鼠脑海马体)中具有优势。虽然3PM主要用于神经科学,但3PM可以潜在地应用于其他组织,如淋巴结,骨骼和肿瘤,以进行深部组织观察。
重要的是要验证成像系统在接近散粒噪声极限的情况下运行,这确保了检测和数据采集电子设备在PMT之后对图像的噪声贡献可以忽略不计。检测到的光子数量的不确定性从根本上受到光子散粒噪声的限制。在典型的多光子显微镜中,使用高增益光电探测器(例如,PMT)可以实现散粒噪声受限性能。光子散粒噪声遵循泊松统计分布,其中分布的标准差等于分布均值的平方根。要验证散粒噪声受限性能,请按照协议部分中的步骤 1.14 操作。
为了避免H2O的光衰减,使用D2O进行浸渍是有帮助的,特别是对于~1,700nm的激发。当使用D2O时,必须每〜10分钟刷新D2O或使用大量D2O以避免在成像过程中更换D2O / H2O。还可以将D2O与室内环境隔离3。如果使用长工作距离(WD)物镜(例如,4毫米或更长的WD)进行成像,浸入液厚度可能超过2-3毫米。增加的厚度使得H2O吸收即使在〜1,300 nm21下也不可忽略不计。因此,当使用长 WD 物镜时,即使对于 1,300 nm 3PM,D2O 也可能是必需的。
由于3P荧光强度取决于焦点处激发脉冲能量的立方体(等式(1)),因此设置适当的激光功率对于获得足够的3P荧光信号同时避免活组织中的热和非线性损伤尤为重要。平均激光功率应保持在热损伤阈值以下。例如,在小鼠大脑中,为了避免热组织损伤,小鼠脑表面上的平均功率应保持在~100 mW或以下,以便在1 mm的深度下激发〜1,300nm,视场(FOV)为230μm x 230μm21。同样,~1,700 nm处的平均功率应保持在~1 mm深度处或低于~50 mW,FOV应保持在~230 μm x 230 μm(未发表的数据)。此外,为避免激发饱和和潜在的非线性损伤,对于~1,300 nm和~1,700 nm激发,激励脉冲能量应分别保持在
2 nJ和3 nJ。
由于组织中的光吸收和散射,在组织穿透1 EAL后,聚焦处的脉冲能量衰减至1/e(~37%)。EAL在不同的组织和激发波长中变化,例如,在小鼠大脑的新皮层中,EAL在〜1,300nm和〜1,700nm处分别为〜3,29〜300μm和〜400μm(图5)。因此,为了在n个EAL的深度上保持相同的脉冲能量(例如,1 nJ /脉冲),需要将表面脉冲能量乘以1 nJ×en。为了对结构和功能动力学进行快速成像,需要具有高重复率(在1 MHz或更高频率下)的激发激光器来实现5,6,7,10的高帧速率。然而,脉冲能量要求和平均激光功率极限限制了适用的重复频率。
例如,当我们在4个EAL处成像一个中等深度的区域时(即,在1,300 nm激发的小鼠皮层中为~1.2 mm),表面需要~55 nJ /脉冲才能在焦点处保持1 nJ /脉冲。当平均功率限制为100 mW时,我们可以应用~2 MHz的激光重复率。然而,要在7个EAL的深度下进行更深的成像,需要在表面约1,100 nJ /脉冲才能在焦点处保持1 nJ /脉冲。假设最大平均功率为100 mW以避免热损伤,激光重复频率应降低至0.1 MHz,以在表面实现1,100 nJ /脉冲。 表 1总结了小鼠大脑皮层的典型成像条件。请注意, 表 1中的成像深度假设EAL在整个小鼠皮层中是均匀的。
此外,由于深部组织3PM中的激光功率限制,在帧速率和图像像素大小之间存在权衡,这对于钙成像等功能成像尤为重要。每个深度的最大可用激光重复率是根据聚焦时所需的脉冲能量和如上所述的适用平均激光功率决定的,例如,在深度相当于1,300nm激发的~4个EAL的深度下为2 MHz。通常,成像需要每个像素至少一个脉冲。因此,最小可用像素停留时间由激光重复率决定,例如,0.5 μs/像素,2 MHz激励。
为了在3P图像中保持高空间分辨率(横向约1μm),理想情况下将1像素设置为〜1μm 2的面积,例如,对于250 x 250μm 2的FOV,设置为256 x256像素。因此,要使用相当大的视场(例如,250 x 250 μm2,256 x 256 像素)、0.5 MHz、1 MHz 和 2 MHz 脉冲重复率执行快速成像,理论最大帧速率分别为 ~7.6、~15 和 ~30 帧/秒。同样,根据目标深度、扫描速度和视场,优化激光重复率也至关重要,以便在热损伤阈值下施加足够的脉冲能量。为了提高成像速度,自适应激发源可以通过按需向神经元31传递激光脉冲来将所有激发脉冲集中在神经元(即感兴趣区域)上。
与2PM相比,在活组织内通过高度散射介质(例如颅骨,骨骼和小鼠大脑的外囊)的深部成像中为2PM相比是有利的。较长的EAL和3PE的高阶非线性激发有利于深部组织成像。例如,为了在小鼠皮层中对GCaMP6进行成像,920nm激发的2P荧光信号高于在690μm的 浅区域激发1,300nm的3P荧光信号(即,1,300nm处的~2.3 EAL)21。然而,由于在1,300 nm处的EAL比920 nm更长,因此3PE在~690μm的深度和更深的21nm处比2P激发(2PE)具有更强的荧光。该深度被定义为“信号交叉深度”,其中2PE和3PE的荧光信号强度相同,具有相同的重复率和相同的最大允许平均功率21。信号交叉深度取决于2PE和3PE的激发波长以及荧光团。
在实践中,由于吸水率较低,920 nm激发允许比1,300 nm激发更高的平均激光功率。然而,2PE的较高平均功率只会将信号交叉深度推高0.9 EAL4。此外,当样品被密集标记时,3PE具有更高的SBR的额外优势。因此,即使在达到信号交叉长度之前,3PM也可以比2PM更适合成像。例如,当对小鼠脑血管系统进行成像时,其体积分数(即标记密度)为〜2%,1,300nm 3PM,100 mW激发功率优于920nm 2PM,在〜700μm深度下具有200mW激发功率的荧光素。
当通过薄但高度散射的层成像时,3PM也有一个优势,该层可能会扭曲激发光束的点扩散函数并产生散焦背景4。例如,通过小鼠大脑的完整头骨,即使在距离大脑表面13<100μm的浅深度处,2PM图像也会遭受散焦背景的影响。在2PM中观察到类似的散焦背景,通过小鼠大脑32中的白质激发1,280nm。因此,当通过浑浊层对组织进行成像时,无论标记密度如何,高对比度成像的3PM优于2PM。
我们最近报道了一个磁珠幻像和理论分析,表明3PM的成像深度极限超过8个EAL33;8个EAL相当于〜3 mm,小鼠皮层激发〜1,700 nm。然而,目前可用的激光没有足够的脉冲能量在小鼠大脑中达到8个EAL。更强激光器的进一步发展将推动当前3PM的成像深度极限。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub和NIH 1U01NS103516的支持。
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |