הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.
Abstract
קספאזות דלקתיות כוללות קספאזה-1, -4, -5, -11 ו -12 ושייכות לתת-קבוצה של קספאזות יוזמות. Caspase-1 נדרש להבטיח ויסות נכון של איתות דלקתי ומופעל על ידי דימריזציה הנגרמת על ידי קרבה לאחר גיוס לדלקת. קספאז-1 מצוי בשפע בשושלת התאים המונוציטית וגורם להבשלה של הציטוקינים הפרו-דלקתיים אינטרלוקין (IL)-1β ו-IL-18 למולקולות מופרשות פעילות. הקספאזות הדלקתיות האחרות, קספאזה-4 ו–5 -(וההומלוגיה שלהן מורין קספאזה-11) מקדמות את שחרור IL-1β על ידי גרימת פירופטוזיס. השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית של קספאזה (BiFC) היא כלי המשמש למדידת קרבה הנגרמת על ידי קספאזה דלקתית כקריאה של הפעלת קספאזה. הקספאזה-1, -4 או -5 פרודומיין, המכילה את האזור הנקשר לדלקת, מתמזגת עם שברים לא פלואורסצנטיים של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב נוגה (Venus-N [VN] או Venus-C [VC]) הקשורים לרפורמה בקומפלקס נוגה הפלואורסצנטי כאשר הקספאזות עוברות קרבה מושרית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכניס את הכתבים האלה למקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים (MDM) באמצעות נוקליאופקציה, לטפל בתאים כדי לגרום להפעלת קספאזה דלקתית ולמדוד את הפעלת הקספאזה באמצעות פלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון של גישה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לזהות את המרכיבים, הדרישות והלוקליזציה של קומפלקס הפעלת הקספאז הדלקתי בתאים חיים. עם זאת, יש לשקול בקרות זהירות כדי למנוע פגיעה בכדאיות ובהתנהגות של התאים. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לניתוח של אינטראקציות קספאז דינמיות ברמה הדלקתית, כמו גם לחקירת מפלי האיתות הדלקתיים ב- MDM חי ובמונוציטים שמקורם בדגימות דם אנושיות.
Introduction
הקספאזות הן משפחה של פרוטאזות ציסטאין אספרטט שניתן לקבץ לתוך קספאזות יוממות וקספאזות תליין. קספאזות תליין כוללות קספאזה-3, -6 ו -7. הם נמצאים באופן טבעי בתאים כדימרים ונבקעים על ידי הקספאזות היוזמות לביצוע אפופטוזיס1. קספאזות יוזמות כוללות קספאזה אנושית-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 ו -12. הם נמצאים כזימוגנים לא פעילים (פרו-קספאזות) המופעלים על ידי דימריזציה הנגרמת על ידי קרבה ומיוצבים על ידי ביקוע פרוטאוליטי אוטומטי 2,3. הקספאזות הדלקתיות הן תת-קבוצה של הקספאזות היוזם2 וכוללות את קספאזה-1, -4, -5 ו-12- בבני אדם, ואת קספאזה-1, -11 ו–12 בעכבר 4,5. במקום תפקיד אפופטוטי, הם ממלאים תפקיד מרכזי בדלקת. הם מתווכים עיבוד פרוטאוליטי והפרשת פרו-אינטרלוקין (IL)-1β ופרו-IL-18 6,7, שהם הציטוקינים הראשונים ששוחררו בתגובה לפולשים פתוגניים 8,9. Caspase-1 מופעלת עם גיוס לפלטפורמת ההפעלה שלה; קומפלקס חלבונים גדול במשקל מולקולרי המכונה הדלקת (איור 1A)10. דימריזציה של קספאזה-4, -5 ו–11- מתרחשת באופן בלתי תלוי בפלטפורמות אלה באמצעות מסלול דלקתי לא קנוני11,12.
דלקת קנונית היא קומפלקסים של חלבונים רב-מתכתיים ציטוזוליים המורכבים מחלבון חיישן מודלק, חלבון המתאם ASC (חלבון דמוי כתם הקשור לאפופטוזיס המכיל CARD), והחלבון המשפיע קספאזה-110. האינפלמזומים הקאנוניים הנחקרים ביותר הם משפחת הקולטנים דמויי ה-NOD המכילים תחום פירין (NLRP), NLRP1 ו-NLRP3, משפחת ה-NLR המכילה כרטיס (NLRC), NLRC4, וההיעדרות במלנומה 2 (AIM2). כל אחד מהם מכיל תחום פירין, כרטיס או שני התחומים. תחום ה-CARD מתווך את האינטראקציה בין קספאזות המכילות כרטיס לבין המפעילים שלהן במעלה הזרם. לכן, מולקולת הפיגום ASC, המורכבת מתחום פירין N-terminal (PYD) וממוטיב C-terminal CARD13,14, נדרשת לגיוס של קספאזה-1 לדלקת NLRP110, NLRP315 ו-AIM216.
כל דלקת נקראת על שם חלבון החיישנים הייחודי שלה שמזהה גירויים פרו-דלקתיים מובהקים (איור 1B). מפעילים של מסלול זה נקראים גירויים קנוניים. דלקות משמשות כחיישנים למרכיבים מיקרוביאליים ולמתח ברקמות, ומורכבות כדי לעורר תגובה דלקתית חזקה באמצעות הפעלה של הקספאזות הדלקתיות17. הרכבה דלקתית יוזמת הפעלת caspase-1 כדי לתווך התבגרות והפרשת המצעים העיקריים שלה pro-IL-1β ו- pro-IL-18. תהליך זה מתרחש באמצעות מנגנון דו-שלבי. ראשית, גירוי ראשוני מעלה את הביטוי של חלבונים דלקתיים מסוימים ופרו-IL-1β באמצעות הפעלה של מסלול NF-κB. שנית, גירוי תוך-תאי (קנוני) משרה הרכבה וגיוס של פרוקספאזה-1 6,7.
קספאזה-4 וקספאזה-5 הם האורתולוגים האנושיים של מורין קספאזה-1111 11. הם מופעלים באופן בלתי תלוי בדלקת על ידי ליפופוליסכריד תוך-תאי (LPS), מולקולה שנמצאת בקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים 18,19,20, ועל ידי heme חוץ-תאי, תוצר של המוליזה של תאי דם אדומים21. הוצע כי LPS נקשר ישירות למוטיב CARD של חלבונים אלה ומשרה את האוליגומריזציה שלהם20. הפעלה של קספאזה-4 או קספאזה-5 מקדמת שחרור IL-1β על ידי גרימת צורה דלקתית של מוות תאי הנקראת פירופטוזיס באמצעות מחשוף של החלבון יוצר הנקבוביות gasdermin D (GSDMD)18,19. בנוסף, השטף של יוני אשלגן הנובע ממוות פירופטוטי בתיווך קספאזה-4 ו-GSDMD גורם להפעלה של דלקת NLRP3 והפעלה לאחר מכן של קספאזה-122,23. לכן, caspase-4, -5 ו–11 נחשבים לחיישנים תוך-תאיים עבור LPS המסוגלים לגרום לפירופטוזיס והפעלת קספאזה-1 בתגובה לגירויים ספציפיים11,24.
איור 1: קספאזות דלקתיות ובדיקת השלמה פלואורסצנטית של קספאזה-בימולקולרית (BiFC). (A) דיאגרמה המציגה את מערכת הקספאזה-BiFC, שבה שני פרודומיינים של קספאזה-1 (C1-pro) המקושרים לכל מקטע שאינו פלואורסצנטי של נוגה (Venus-C או Venus-N) מגויסים לפלטפורמת ההפעלה NLRP3, מה שמאלץ את נוגה לחזור ולפלואורסצנט. קומפלקס זה מופיע כנקודה ירוקה מתחת למיקרוסקופ ומשמש כקריאה לקרבה דלקתית המושרה על ידי קספאזה, שהיא הצעד הראשון בהפעלת קספאזה יזומה. (B) סכמטי המציג את ארגון התחום של רכיבים דלקתיים וקספאזות דלקתיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
מדידת הפעלת קספאזות יוזמות ספציפיות היא קשה, ואין הרבה שיטות זמינות לעשות זאת על ידי גישות הדמיה. ניתן להשתמש בהשלמת פלואורסצנציה דו-מולקולרית של קספאזה (BiFC) כדי לדמיין הפעלת קספאזה דלקתית ישירות בתאים חיים (איור 1A)25. טכניקה זו הותאמה לאחרונה לשימוש במקרופאג’ים שמקורם במונוציטים אנושיים (MDM)21. Caspase BiFC מודד את הצעד הראשון בהפעלת קספאזה דלקתית, קרבה מושרית כדי להקל על דימריזציה. נעשה שימוש בביטוי של פלסמידים המקודדים את ה-caspase prodomain המכיל CARD, שהתמזגו עם שברים שאינם פלואורסצנטיים של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב הניתן לצילום נוגה (Venus-C [VC]) ו-Venus-N [VN]). כאשר שני הפרודומים של הקספאזה מגויסים לפלטפורמת ההפעלה שלהם או עוברים קרבה מושרית, שני חצאי נוגה מובאים בסמיכות ונאלצים להתאושש ולהפלואורס (ראו איור 1A,B). זה מספק קריאה בזמן אמת של הפעלת קספאזה דלקתית ספציפית.
MDM אנושי מבטא בשפע גנים דלקתיים וקולטנים לזיהוי דפוסים המזהים אותות סכנה ומוצרים פתוגנים. זה מספק סוג תא אידיאלי לחקירת מסלולי קספאזה דלקתיים. בנוסף, הם יכולים להיות נגזרים מדם היקפי ואפילו מדגימות חולים כדי להעריך הפעלת קספאזה דלקתית במצב מחלה מסוים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכניס את כתבי הקספאזה של BiFC ל-MDM באמצעות נוקליאופקציה, שיטת טרנספקציה מבוססת אלקטרופורציה, כיצד לטפל בתאים כדי לגרום להפעלת קספאזה דלקתית, וכיצד לדמיין את קומפלקסי הקספאזה הפעילים באמצעות גישות מיקרוסקופיה. בנוסף, ניתן להתאים מתודולוגיה זו כדי לקבוע את ההרכב המולקולרי של קומפלקסים אלה, לוקליזציה תת-תאית, קינטיקה וגודלם של מבנים מסודרים אלה 25,26,27.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים ממונוציטים שבודדו מדגימות דם אנושיות ושיטה להחדרה יעילה של כתבי ה-BiFC של הקספאזה הדלקתית לתוך MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים.
פרוטוקול זה מנצל את טכניקת BiFC35 כדי לתייג את הקספאזות הדלקתיות בתחו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה של LBH בעבר ובהווה שתרמו לפיתוח טכניקה זו. מעבדה זו נתמכת על ידי NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK12DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). איור 2 צויר באמצעות תוכנת Biorender.
Materials
| 48 well tissue culture2:34 plates | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm Tissue Culture Dishes | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS columns | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Rinsing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMacs running buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit | Zeiss | Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| DPBS without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | Available by request from LBH lab | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes |
| Nigericin sodium salt, ready made solution | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software | Zeiss | Any software used to operate the confocal microscope of choice |
Referências
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
- Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
- Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
- Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
- Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
- Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
- van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
- Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
- Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
- Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
- Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
- Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
- Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
- Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
- Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
- Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
- Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
- Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
- Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
- Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
- Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
- Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
- Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).
