Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

El dicroísmo circular (CD) es una técnica espectroscópica que se basa en la quiralidad inherente de las macromoléculas biológicas que conduce a la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente diestra y zurda. Esta absorción diferencial se conoce como dicroísmo circular. La técnica, por lo tanto, se puede utilizar para delinear la conformación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ADN, que contienen centros ^quirales1,2.

Las ondas electromagnéticas contienen componentes eléctricos y magnéticos. Tanto el campo eléctrico como el magnético oscilan perpendicularmente a la dirección de propagación de la onda. En el caso de la luz no polarizada, estos campos oscilan en muchas direcciones. Cuando la luz está polarizada circularmente, se obtienen dos campos electromagnéticos a 90° de diferencia de fase entre sí. Las moléculas quirales muestran rotación óptica circular (birrefringencia) tal que absorberán la luz polarizada circularmente diestra y la luz polarizada circularmente zurda en diferentes ^grados3. El campo eléctrico resultante se trazará como una elipse, una función de la longitud de onda. El espectro de CD se registra, por lo tanto, como elipticidad (q), y los datos se presentan como elipticidad de residuo medio en función de la longitud de onda.

En el caso de las proteínas, el Cα de los aminoácidos (excepto la glicina) es quiral, y este es explotado por espectroscopia de CD para determinar la estructura secundaria de esta macromolécula4. Los espectros de CD de las moléculas de proteínas se registran típicamente en el rango UV lejano. α las proteínas helicoidales tienen dos bandas negativas a 222 nm y 208 nm y un pico positivo a 193 ^nm4. Las proteínas con estructura secundaria antiparalela de lámina β muestran un pico negativo a 218 nm y un pico positivo a 195 ^nm4. Las proteínas con estructuras desordenadas muestran baja elipticidad cerca de 210 nm y un pico negativo a 195 ^nm4. Por lo tanto, los picos / bandas bien definidos para diferentes estructuras secundarias hacen que la EC sea una herramienta conveniente para dilucidar los cambios conformacionales que ocurren en la estructura secundaria de las proteínas durante la desnaturalización, así como la unión al ligando.

Los ácidos nucleicos tienen tres fuentes de quiralidad: la molécula de azúcar, la helicidad de la estructura secundaria y el ordenamiento terciario de largo alcance del ADN en el medio ^ambiente5,6. Los espectros de CD de los ácidos nucleicos se registran típicamente en el rango de 190 a 300 ^nm5,6. Cada conformación de ADN, al igual que las proteínas, da un espectro característico, aunque los picos/bandas pueden variar en algunos grados debido a las condiciones de los disolventes y las diferencias en las secuencias de ^ADN7. El ADN-B, la forma más común, se caracteriza por un pico positivo alrededor de 260-280 nm y un pico negativo alrededor de 245 ^nm6. Los picos/bandas de ADN en forma de B son generalmente pequeños porque los pares de bases son perpendiculares a la doble hélice, lo que confiere una quiralidad débil a la molécula. El ADN-A da un pico positivo dominante a 260 nm y un pico negativo alrededor de 210 ^nm6. Z-DNA, la hélice zurda, da una banda negativa a 290 nm y un pico positivo alrededor de 260 ^nm6. Este ADN también da un pico extremadamente negativo a 205 ^nm6.

Además de estas conformaciones, el ADN también puede formar tríplex, cuadrúplex y horquillas, todos los cuales se pueden distinguir mediante espectroscopia de CD. El G-quadruplex paralelo da una banda positiva dominante a 260 nm, mientras que el G-quadruplex antiparalelo da una banda negativa a 260 nm y un pico positivo a 290 nm, lo que facilita la distinción entre las dos formas de estructuras ^cuadrúplex6. Los tríplex no dan un espectro ^{característico8}. Por ejemplo, los espectros de un ADN de 36 nucleótidos de largo con el potencial de formar una triple hélice intramolecular que contiene pares de bases G.G.C y T.A.T en presencia de Na⁺ muestran una fuerte banda negativa a 240 nm y un amplio pico positivo. El amplio pico positivo muestra contribuciones en 266, 273 y 286 nm. El mismo oligonucleótido en presencia de Na⁺ y Zn⁺ muestra cuatro bandas negativas (213, 238, 266 y 282 nm) y un pico positivo a 258 nm. Por lo tanto, los espectros del ADN triplex pueden variar dependiendo de las condiciones de ^sal8.

Además de estas conformaciones, los espectros de CD han permitido la identificación de otra forma de ADN llamada X-DNA. El ADN-X se forma cuando la secuencia de ADN contiene residuos alternativos de adenina y timina. Los espectros CD de X-DNA contienen dos picos negativos a 250 y 280 nm. Se dispone de muy poca información sobre el ADN-X, aunque se ha especulado que funciona como un sumidero para el superboling ^positivo6,9. Los cambios en los espectros de CD también pueden revelar detalles sobre las interacciones ligando-proteína y, por lo tanto, se han agregado al arsenal de métodos moleculares para detectar interacciones fármaco-proteína10,11,12,13,14. Los espectros de CD también se han utilizado para monitorizar los cambios en la estructura secundaria de las proteínas durante el proceso de ^{plegamiento15}. Del mismo modo, los espectros de CD también se pueden utilizar para sondear las interacciones ligando-ADN16,17.

La espectroscopia de CD, por lo tanto, es un método fácil y económico para distinguir entre las diferentes formas de conformación del ADN, siempre que haya acceso a equipos y software no tan económicos. El método es extremadamente sensible y rápido. Solo requiere una pequeña cantidad de ADN, lo que le da una ventaja sobre la técnica alternativa de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Las valoraciones con ligandos y sustratos también son fáciles de realizar. La principal limitación es que el ADN debe ser altamente puro. Es aconsejable utilizar ADN purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

La información obtenida por los espectros de CD se ha utilizado principalmente para deducir las características estructurales de las proteínas y para identificar distintos conformadores de ADN. En este estudio, los espectros de CD se han utilizado para integrar los resultados obtenidos de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) in vivo para delinear si la proteína de interés / factor de transcripción predicho puede provocar un cambio conformacional en la región promotora de sus genes efectores. Esta colaboración ayuda en el progreso de las técnicas espectroscópicas tradicionales de CD al predecir el mecanismo de regulación de la transcripción por el factor de transcripción predicho en y alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de un promotor.

La remodelación de la cromatina es un mecanismo bien definido conocido por regular los procesos metabólicos del ADN al hacer que la cromatina estrechamente empaquetada sea accesible a varios factores reguladores, como factores de transcripción, componentes de replicación del ADN o proteínas de reparación de daños. Los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, también conocidos como la familia de proteínas SWI/SNF, son proteínas remodeladoras clave presentes en las células eucariotas18,19. La agrupación filogenética ha categorizado la familia de proteínas SWI/SNF en 6 ^subgrupos20: similar a Snf2, similar a Swr1, similar a SSO1653, similar a Rad54, similar a Rad5/16 y distante. SMARCAL1, la proteína de interés en este estudio, pertenece al subgrupo ^distante20. Esta proteína se ha utilizado para investigar su modo de regulación transcripcional mediante espectroscopia de CD.

Se ha demostrado que la mayoría de los miembros de las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP reposicionan o desalojan nucleosomas o median el intercambio de variantes de histonas de manera dependiente de ^ATP21,22. Sin embargo, no se ha demostrado que algunos miembros de esta familia remodelen nucleosomas, por ejemplo, SMARCAL1. A pesar de que los estudios han demostrado que SMARCAL1 se asocia con cromosomas de politeno, falta evidencia experimental sobre su capacidad para remodelar nucleosomas23. Por lo tanto, se postuló que SMARCAL1 puede regular la transcripción alterando la conformación del ^ADN24. La espectroscopia de CD proporcionó un método fácil y accesible para validar esta hipótesis.

SMARCAL1 es una proteína remodeladora de cromatina dependiente de ATP que funciona principalmente como una helicasa de recocido25,26,27. Se ha postulado modular la transcripción mediante la remodelación de la conformación del ^ADN24. Para probar esta hipótesis, se estudió el papel de SMARCAL1 en la regulación de la transcripción de genes durante el daño al ADN inducido por doxorrubicina. En estos estudios, se utilizó SMARCAL1 para el análisis in vivo y ADAAD para los ensayos de ^vitro28,29. Estudios previos han demostrado que ADAAD puede reconocer el ADN de una manera dependiente de la estructura pero independiente de la ^{secuencia30,31}. La proteína se une de manera óptima a las moléculas de ADN que poseen regiones de transición de doble cadena a una sola cadena, similar al ADN del asa del tallo, e hidroliza ATP ^30,31.

Los experimentos in vivo mostraron que SMARCAL1 regula la expresión de MYC, DROSHA, DGCR8 y DICER al unirse a las regiones ^{promotoras28,29}. La región de interacción fue identificada por experimentos ^ChIP28,29. La técnica ChIP se utiliza para analizar la interacción de una proteína con su ADN cognado dentro de la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas, como los factores de transcripción en los promotores u otros sitios de unión al ADN, están unidas a áreas genómicas específicas. La proteína unida al ADN se reticula primero usando formaldehído. Esto es seguido por el aislamiento de la cromatina. La cromatina aislada se cizalla a fragmentos de 500 pb, ya sea por sonicación o digestión de nucleasas, y la proteína unida al ADN se inmunoprecipita utilizando anticuerpos específicos de la proteína. La reticulación se invierte y el ADN se analiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR cuantitativa en tiempo real.

Los resultados de ChIP llevaron a la hipótesis de que SMARCAL1 posiblemente media la regulación transcripcional al inducir un cambio conformacional en las regiones promotoras de estos genes. Se utilizaron el mapeador QGRS y el software Mfold para identificar el potencial de estas regiones promotoras para formar estructuras ^{secundarias28,29}. El mapeador QGRS se utiliza para predecir G-quadruplexes32, mientras que ^Mfold33 analiza la capacidad de una secuencia para formar estructuras secundarias como los bucles de tallo.

Después del análisis de la estructura secundaria, se realizaron más experimentos in vitro con el dominio ATPasa A dependiente del ADN activo (ADAAD) recombinante 6X His-tagged, el homólogo bovino de SMARCAL1, purificado de Escherichia ^coli34. Los ensayos de ATPasa se realizaron utilizando ADAAD para establecer que las secuencias de ADN identificadas podían actuar como ^{efectores28,29}. Finalmente, se realizó espectroscopia de CD para monitorizar los cambios conformacionales inducidos en la molécula de ADN por ^ADAAD28,29.

Para demostrar que la actividad atpasa de la proteína era esencial para inducir un cambio conformacional en la molécula de ADN, se añadió ácido tetraacético etilendiamina (EDTA) a quelato Mg⁺² o neomicina inhibidor del dominio ATPasa A dependiente activo del ADN (ADAADiN), un inhibidor específico de la proteína SWI/SNF35,36 . Esta técnica espectroscópica de CD se puede utilizar con cualquier proteína purificada que haya sido demostrada por ChIP o cualquier otro ensayo relevante para unirse a una región genómica predicha de un promotor.