Summary
È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l'estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.
Abstract
Il glicogeno epatico è un polimero di glucosio iperramificato coinvolto nel mantenimento dei livelli di zucchero nel sangue negli animali. Le proprietà del glicogeno sono influenzate dalla sua struttura. Quindi, un metodo di estrazione adatto che isoli campioni rappresentativi di glicogeno è fondamentale per lo studio di questa macromolecola. Rispetto ad altri metodi di estrazione, un metodo che impiega una fase di centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio può ridurre al minimo il danno molecolare. Sulla base di questo metodo, una recente pubblicazione descrive come la densità della soluzione di saccarosio utilizzata durante la centrifugazione sia stata variata (30%, 50%, 72,5%) per trovare la concentrazione più adatta per estrarre particelle di glicogeno di un'ampia varietà di dimensioni, limitando la perdita di particelle più piccole. È stata introdotta una fase di ebollizione di 10 minuti per testare la sua capacità di denaturare gli enzimi che degradano il glicogeno, preservando così il glicogeno. La più bassa concentrazione di saccarosio (30%) e l'aggiunta della fase di ebollizione hanno dimostrato di estrarre i campioni più rappresentativi di glicogeno.
Introduction
Il glicogeno è un polimero complesso e iperramificato del glucosio che si trova negli animali, nei funghi e nei batteri1. Nei mammiferi, il glicogeno epatico funziona come un tampone glicemico, preservando l'omeostasi, mentre il glicogeno muscolare agisce come un serbatoio di glucosio a breve termine per fornire energia direttamente2. La struttura del glicogeno è spesso descritta da tre livelli (mostrati nella Figura 1): 1. Le catene lineari sono formate da monomeri di glucosio tramite legami glicosidici (1→4)-α, con punti di diramazione collegati tramite legami glicosidici (1→6)-α; 2. particelle β altamente ramificate (~20 nm di diametro) che, soprattutto in tessuti come il muscolo scheletrico, agiscono come molecole indipendenti di glicogeno 3,4; 3. particelle di glicogeno α più grandi (fino a 300 nm di diametro) costituite da unità di glicogeno β più piccole, che si trovano nel fegato5, nel cuore6 e in alcune specie non mammiferi7. Le particelle di α epatica dei topi diabetici sono molecolarmente fragili, con una propensione a degradarsi in particelle β quando vengono disciolte in dimetilsolfossido (DMSO), mentre α particelle dei controlli non diabetici rimangono generalmente invariate. Un'ipotesi è che questa fragilità possa esacerbare lo scarso equilibrio glicemico osservato nel diabete, con le fragili particelle α che potrebbero comportare percentuali più elevate della particellaβ 8,9,10,11 degradata più rapidamente.
I metodi tradizionali di estrazione del glicogeno utilizzano le condizioni relativamente difficili di esposizione del tessuto epatico a una soluzione alcalina calda12 o a soluzioni acide come l'acido tricloroacetico (TCA)13 o l'acido perclorico (PCA)14. Sebbene siano efficaci nel separare il glicogeno da altri componenti del tessuto epatico, questi metodi degradano inevitabilmente la struttura del glicogeno in una certa misura15,16. Sebbene questi metodi siano adatti per la misurazione quantitativa del contenuto di glicogeno, non sono ideali per gli studi incentrati sull'ottenimento di informazioni strutturali sul glicogeno a causa di questo danno strutturale. Dallo sviluppo di questi metodi, è stata sviluppata una procedura di estrazione più blanda che utilizza il tampone Tris a freddo (che ha dimostrato di inibire la degradazione della glucosidasi) con ultracentrifugazione a gradiente di densitàdel saccarosio 17,18,19. Con il pH controllato a ~8, questo metodo non sottopone il glicogeno all'idrolisi acida o alcalina osservata nelle procedure precedenti.
L'ultracentrifugazione a gradiente di densità del saccarosio del tessuto epatico omogeneizzato può separare le particelle di glicogeno dalla maggior parte del materiale cellulare. Se necessario, un'ulteriore purificazione può essere eseguita mediante cromatografia preparativa ad esclusione dimensionale, con conseguente raccolta di glicogeno purificato con proteine associate al glicogeno20. Sebbene questo metodo, in condizioni più miti, abbia maggiori probabilità di preservare la struttura del glicogeno, è difficile evitare che una parte del glicogeno venga persa nel surnatante, in particolare le particelle di glicogeno più piccole che sono meno dense15. Un'altra potenziale causa di perdita di glicogeno è che le condizioni più miti consentono una certa degradazione enzimatica, con conseguente minore resa di glicogeno rispetto ai metodi di estrazione più difficili. Recenti ricerche hanno riportato l'ottimizzazione del metodo di estrazione del glicogeno epatico per preservare la struttura del glicogeno21. Qui, sono state testate varie concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%) per determinare se concentrazioni di saccarosio più basse riducessero al minimo la perdita di particelle di glicogeno più piccole. La logica era che la densità inferiore avrebbe permesso alle particelle più piccole e meno dense di penetrare nello strato di saccarosio e aggregarsi nel pellet con il resto del glicogeno.
In questo studio, i metodi di estrazione con e senza una fase di ebollizione di 10 minuti sono stati confrontati per verificare se gli enzimi di degradazione del glicogeno potessero essere denaturati, con conseguente estrazione di più glicogeno che era anche esente da degradazione parziale. Per determinare la struttura del glicogeno estratto sono state utilizzate le distribuzioni delle dimensioni molecolari intere e le distribuzioni della lunghezza della catena di glicogeno, in modo simile a un'ottimizzazione dell'estrazione dell'amido pubblicata in precedenza22. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) con rilevazione dell'indice di rifrazione differenziale (DRI) è stata utilizzata per ottenere le distribuzioni dimensionali del glicogeno, che descrivono il peso molecolare totale in funzione delle dimensioni molecolari. L'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE) è stata utilizzata per analizzare le distribuzioni della lunghezza della catena, che descrivono il numero relativo di catene glucosidiche di ciascuna dimensione (o grado di polimerizzazione). Questo documento descrive la metodologia di estrazione del glicogeno dai tessuti epatici sulla base del precedente studio di ottimizzazione21. I dati suggeriscono che il metodo più adatto per preservare la struttura del glicogeno è una concentrazione di saccarosio del 30% con una fase di ebollizione di 10 minuti.
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Protocol
Fegati di topo utilizzati per ottimizzare questa procedura,21 provenivano da 12 topi maschi BKS-DB/Nju (7,2 settimane di età, vedere la tabella dei materiali). L'uso degli animali è stato approvato dal Comitato Etico e per la Cura degli Animali dell'Università di Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Tessuti animali
- Pesare il fegato di topo (1-1,8 g di fegato intero di ciascun topo).
- Congelare rapidamente il fegato di topo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C.
2. Preparazione del tampone e dei reagenti
- Preparare un tampone di isolamento del glicogeno contenente 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF e 5 mM pirofosfato di sodio con acqua deionizzata e regolare il pH a 8.
- Preparare una soluzione di saccarosio al 30% (p/p) (risultata ottimale per il glicogenoepatico 21).
- Preparare tampone in acetato di sodio (1 M, pH 4,5), tampone acido acetico (0,1 M, pH 3,5), soluzione di idrossido di sodio (0,1 M) e cianoboroidruro di sodio (1 M).
- Preparare una soluzione di 8-amminopirene-1,3,6-trisolfonato (APTS) aggiungendo 5 mg di APTS a 50 μL di acido acetico glaciale al 15%.
- Preparare una soluzione di nitrato di ammonio contenente 50 mM di nitrato di ammonio con lo 0,02% di sodio azide.
3. Estrazione del glicogeno (Figura 2)
- Trasferire il tessuto epatico congelato (~1 g) in una provetta da 15 mL contenente 6 mL di tampone per l'isolamento del glicogeno.
- Tenendolo in ghiaccio, omogeneizzare il tessuto epatico usando un omogeneizzatore per tessuti.
- Trasferire metà della sospensione (3 mL) in una nuova provetta e far bollire per 10 minuti (dimostrata ottimale per gli studi strutturali del glicogeno21). Tenere l'altra metà della sospensione (3 ml) su ghiaccio per estrarre il glicogeno contenente le proteine associate che non sono denaturate.
NOTA: I campioni non bolliti devono essere sempre tenuti in ghiaccio durante le fasi di estrazione del glicogeno. Se le proteine del glicogeno non sono importanti per lo studio, l'intero campione può subire la fase di ebollizione di 10 minuti. - Rimuovere un'aliquota di 8 μL da ciascuna provetta, conservare le aliquote su ghiaccio e utilizzarle per la determinazione del contenuto di glicogeno (vedere paragrafo 4).
- Centrifugare la sospensione rimanente a 6.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
- Trasferire i surnatanti in provette per ultracentrifuga e centrifugarli a 3,6 × 105 g per 90 minuti a 4 °C.
- Scartare i surnatanti rimanenti e risospendere i pellet in 1,5 mL di tampone di isolamento del glicogeno.
- Stratificare i campioni su 1,5 mL di soluzione di saccarosio al 30% in provette da ultracentrifuga da 4 mL e centrifugare a 3,6 × 105 g per 2 ore a 4 °C.
- Scartare i surnatanti rimanenti e risospendere i pellet in 200 μL di acqua deionizzata.
- Aggiungere 800 μL di etanolo assoluto alle sospensioni e mescolare bene per far precipitare il glicogeno23,24. Conservare le miscele a -20 °C per almeno 1 ora per consentire la precipitazione.
- Centrifugare i campioni a 6.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Scartare i surnatanti e risospendere i pellet in 200 μL di acqua deionizzata.
- Ripetere questo processo di precipitazione dell'etanolo 3 volte e risospendere il pellet di glicogeno finale in 200 μL di acqua deionizzata.
- Rimuovere un'aliquota di 8 μL da ciascuna provetta per la determinazione del contenuto di glicogeno (vedere paragrafo 4).
- Congelare i surnatanti rimanenti in azoto liquido e liofilizzare (liofilizzare) per una notte. Conservare i campioni di glicogeno secco nel congelatore a -20 °C.
NOTA: I campioni di glicogeno secco devono essere stabili a -20 °C; Tuttavia, non ci sono dati che indichino quanto durino senza modifiche strutturali.
4. Determinazione del contenuto di glicogeno (Figura 3)
- Aggiungere 8 μL di surnatanti di glicogeno (vedere paragrafi 3.13 e 3.4), 5 μL di amiloglucosidasi (3269 U/mL) e 100 μL di tampone in acetato di sodio (1 M, pH 4,5) in una provetta per microcentrifuga e riempire la provetta fino a 500 μL con acqua deionizzata.
- Preparare controlli che utilizzino acqua deionizzata al posto dell'amiloglucosidasi.
- Incubare i campioni a 50 °C per 30 minuti, mantenendo i controlli sul ghiaccio.
- Centrifugare a 6.000 × g a 4 °C per 10 minuti e miscelare 300 μL di ciascun surnatante risultante con 1 mL di reagente glucosidasi ossidasi/perossidasi (GOPOD).
- Costruire una curva di calibrazione mescolando 300 μL di acqua denionizzata contenente 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg di D-glucosio con 1 mL di reagente GOPOD.
- Incubare le miscele a 50 °C per altri 30 min.
- Leggere l'assorbanza (510 nm) di ciascun campione utilizzando piastre a 96 pozzetti (150 μL per pozzetto) utilizzando uno spettrofotometro UV-vis.
- Sottrarre le assorbanze dei campioni di controllo (senza amiloglucosidasi) dalle assorbanze dei campioni sperimentali, quindi calcolare il contenuto di glicogeno in base alla curva standard D-glucosio.
5. Determinazione della resa grezza, della resa di glicogeno e della purezza
- Per la resa grezza, pesare il campione di glicogeno liofilizzato e calcolare la resa come percentuale del tessuto epatico umido.
NOTA: Questa resa deve essere regolata per correggere le aliquote prese in ogni fase del contenuto di glicogeno. - Per la purezza del glicogeno, determinare il contenuto di glicogeno nei pellet finali, come descritto nella sezione 4. Calcolare la purezza come percentuale del tenore di glicogeno determinato rispetto alla resa grezza (cfr. punto 5.1).
- Per la resa di glicogeno, determinare il tenore di glicogeno dei campioni omogeneizzati senza ebollizione e prima di qualsiasi centrifugazione, come descritto al paragrafo 4. Calcolare la resa di glicogeno come percentuale del contenuto di glicogeno nei pellet finali (vedere il punto 5.2) rispetto al contenuto di glicogeno determinato nell'omogenato iniziale.
6. Analisi delle distribuzioni della lunghezza della catena (Figura 4)
- Pesare 0,5 mg di glicogeno liofilizzato in provette da 1,5 ml.
- Aggiungere 90 μL di acqua deionizzata e 1,5 μL di sodio azide (0,04 g/mL) nelle provette.
- Aggiungere 5 μL di tampone acido acetico (0,1 M, pH 3,5) e 2 μL di soluzione di isoamilasi (180 U/mg) alle provette per deramificare il glicogeno.
- Incubare i campioni a 37 °C per 3 ore.
- Aggiungere 5 μL di soluzione di idrossido di sodio (0,1 M) ai campioni per aumentare il pH a 7,0.
- Congelare i campioni in azoto liquido e liofilizzare (liofilizzare) per una notte.
- Aggiungere 2 μL di soluzione di APTS (5 mg di APTS in 50 μL di acido acetico glaciale al 15%) e 2 μL di cianoboroidruro di sodio (1 M) al glicogeno deramificato liofilizzato.
- Centrifugare i campioni a 4.000 × g per 2 minuti.
- Incubare i campioni a 60 °C per 3 ore al buio.
NOTA: Il tubo può essere coperto con un foglio di alluminio per proteggere il contenuto dalla luce. - Aggiungere 200 μL di acqua deionizzata ai campioni e vorticarli fino a quando tutto il precipitato non si è sciolto.
- Centrifugare i campioni a 4.000 × g per 2 minuti.
- Trasferire aliquote di 50 μL in microfiale per elettroforesi di carboidrati assistite da fluorofori (FACE) per l'analisi.
NOTA: I dati sono indicati come l'abbondanza relativa di catene (deramificate) (Nde(X)) per ogni grado di polimerizzazione (DP, simbolo X).
7. Analisi delle distribuzioni dimensionali molecolari (Figura 5)
- Sciogliere 0,5 mg di glicogeno liofilizzato in 50 mM di nitrato di ammonio e 0,02% di sodio azide a 1 mg/mL.
- Incubare i campioni in un termomiscelatore a 80 °C per 3 ore a 300 giri/min.
- Iniettare i campioni in un sistema SEC utilizzando una precolonna e colonne da 1000 Å e 10.000 Å a 80 °C con una portata di 0,3 mL/min (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare un rivelatore di indice di rifrazione per determinare il peso relativo delle molecole a ciascun volume di eluizione.
- Utilizzando gli standard pullulani (PSS) con masse molari comprese tra 342 e 1,22 × 106, tracciare una curva di calibrazione universale SEC per convertire il tempo di eluizione in Rh (raggio idrodinamico). Esprimere i dati del rivelatore dell'indice di rifrazione differenziale (DRI) come distribuzione del peso SEC w (log Rh) in funzione di Rh.
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Representative Results
Mentre la procedura sopra descritta è per il metodo più ottimale (30% di saccarosio con l'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti), i dati sono qui forniti per il glicogeno estratto tramite tre concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%), con e senza una fase di ebollizione, come descritto in precedenza21. Seguendo il protocollo, la purezza, la resa grezza e la resa di glicogeno del glicogeno secco estratto in condizioni diverse sono riportate nella Tabella 1, riprodotta da21. Non sono state riscontrate differenze significative nella resa grezza e nella resa di glicogeno tra i gruppi estratti con le varie condizioni. Al contrario, la purezza del glicogeno è stata significativamente influenzata sia dalle concentrazioni di saccarosio (Tabella 1, P < 0,001) sia dall'aggiunta di una fase di ebollizione (Tabella 1, P < 0,0001). Il glicogeno con la massima purezza è stato estratto utilizzando la concentrazione di saccarosio del 30% insieme a una fase di ebollizione di 10 minuti, motivo per cui è stato determinato che è il più ottimale tra le condizioni testate.
Le distribuzioni delle dimensioni molecolari sono state utilizzate per valutare gli effetti delle varie condizioni sulle dimensioni delle molecole nell'estratto finale. Questi sono stati ottenuti utilizzando un sistema SEC acquoso, come descritto in precedenza25. La normalizzazione di ciascuna distribuzione allo stesso valore massimo ha permesso di confrontare la proporzione relativa tra particelle α e β di ciascun metodo, mostrato nella Figura 6, riprodotta da21. L'Rh in corrispondenza del quale si verificano i massimi (Rh,max) e l'R h medio (
) sono riportati nella Tabella 2, riprodotta a partire da21. Le molecole di glicogeno con Rh < 30 nm sono state definite come particelle β11. Il contenuto di particelle β è stato calcolato come l'area sotto la curva (AUC) di (R h < 30 nm)/AUC (Rh totale). I campioni bolliti avevano valori medi di Rh più bassi e un contenuto di particelle β più elevato rispetto ai campioni non bolliti (Tabella 2, P < 0,05). Concentrazioni più basse di saccarosio hanno portato a valori più bassi e a un contenuto di particelle β più elevato (Tabella 2, P <0,05). L'introduzione di una fase di ebollizione ha inoltre portato a valori di Rh,max più bassi (Tabella 2, P<0,05), mentre la concentrazione di saccarosio non ha avuto alcun effetto significativo.
Le distribuzioni di lunghezza della catena (CLD) forniscono il numero relativo di catene di ciascuna lunghezza data (numero di unità di glucosio collegate, o grado di polimerizzazione), ottenute utilizzando FACE. I CLD sono mostrati nella Figura 7, riprodotta utilizzando i dati di21. La lunghezza media numerica della catena (ACL) è stata calcolata come (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (Tabella 2). Gli ACL dei campioni non bolliti erano significativamente più piccoli e più vari di quelli dei campioni bolliti (Tabella 2, P < 0,05). Tuttavia, la concentrazione di saccarosio non ha influenzato in modo significativo gli ACL. Ciò ha supportato l'ipotesi che la bollitura dei campioni per 10 minuti come fase di pre-estrazione avrebbe preservato la struttura del glicogeno. Il meccanismo proposto è la denaturazione degli enzimi che degradano il glicogeno.
Figura 1: I tre livelli della struttura del glicogeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Processo di estrazione del glicogeno. Passaggi per estrarre e purificare il glicogeno dal fegato di topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Determinazione del contenuto di glicogeno. Passaggi per determinare il contenuto di glicogeno nell'omogenato epatico, nel glicogeno secco purificato o nella soluzione di glicogeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi delle distribuzioni di lunghezza della catena. Passaggi per analizzare le distribuzioni della lunghezza della catena mediante un sistema di elettroforesi dei carboidrati assistito da fluorofori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi delle distribuzioni dimensionali molecolari. Passaggi per analizzare le distribuzioni dimensionali molecolari mediante un sistema di cromatografia acquosa ad esclusione dimensionale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Distribuzioni del peso SEC del glicogeno epatico di topo intero (non deramificato). L'estrazione è stata eseguita in condizioni diverse, normalizzate per avere lo stesso massimo in w(log Rh). Ogni omogenato di fegato è stato diviso in sei volumi uguali e il glicogeno è stato estratto dal 30%, 50% o 72,5% di saccarosio, bollito o non bollito. Le curve rappresentano la media in un dato Rh con la SD fornita su entrambi i lati della linea principale (n = 4-6 con campioni che hanno un segnale insufficiente rispetto al rumore che viene rimosso). (A) Glicogeno estratto con il 30% di saccarosio, bollito o non cotto; (B) glicogeno estratto al 50% con saccarosio, bollito o non bollito; (C) glicogeno estratto dal 72,5% di saccarosio, bollito o non bollito. Questa figura è stata adattata da21. Abbreviazioni: SEC = cromatografia ad esclusione dimensionale; SD = deviazione standard; Rh = raggio idrodinamico; w(log Rh) = Distribuzione del peso SEC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Distribuzioni della lunghezza della catena, Nde(X), del glicogeno. L'analisi della lunghezza della catena è stata eseguita su sei fegati, sia bolliti che non bolliti, utilizzando concentrazioni di saccarosio del 30%, 50% e 72,5% nella fase di ultracentrifugazione. I valori per ogni DP rappresentano la media ± SD (N = 6). (A) Glicogeno estratto con il 30% di saccarosio, bollito o non cotto; (B) glicogeno estratto al 50% con saccarosio, bollito o non bollito; (C) glicogeno estratto dal 72,5% di saccarosio, bollito o non bollito. Questa figura è stata adattata da21. Abbreviazione: Nde(X) = distribuzione della lunghezza della catena. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Rendimento greggio (%) | Purezza (%) | Resa di glicogeno (%) | |
| 30% Saccarosio-c | 2,1 ± 1,0A | 13,1 ± 12,0b | 10,7 ± 9,1A |
| 50% Saccarosio-c | 1,2 ± 0,7A | 23,3 ± 20,1b | 10,2 ± 8,1A |
| 72,5% Saccarosio-c | 1,9 ± 0,8A | 9,8 ± 9,0 b | 5,3 ± 2,4A |
| 30% Saccarosio-b | 0,8 ± 0,4A | 67,9 ± 16,8A | 16,0 ± 5,1A |
| 50% Saccarosio-b | 1,1 ± 0,6A | 48,6 ± 16,9A | 14,8 ± 7,6A |
| 72,5% Saccarosio-b | 2,0 ± 0,9A | 14,7 ± 12,6b | 6,9 ± 3,7A |
| ANOVA a due vie | Saccarosio: P = 0,053 | Saccarosio: P < 0,001 | Saccarosio: P = 0.034 |
| Temperatura: P = 0.108 | Temperatura: P < 0.0001 | Temperatura: P = 0.116 | |
| Interazione: P = 0.11 | Interazione: P = 0.003 | Interazione: P = 0.801 |
Tabella 1: Purezza, resa grezza, resa in glicogeno. Resa grezza, purezza e resa di glicogeno per campioni di glicogeno epatico estratti con saccarosio al 30%, 50% o 72,5%, bollito o non bollito. -c erano campioni estratti da tampone freddo; -b sono stati estratti campioni mediante ebollizione per 10 min. I valori sono indicati come media ± deviazione standard (SD), n = 6. Le differenze nei valori con lettere in apice diverse nella stessa colonna sono statisticamente significative (P < 0,05). Questa tabella è stata riprodotta con il permesso di21.
|
Media Rh,max | β contenuto | ACL medio | |
| 30% Saccarosio-c | 29,4 ± 1,5b | 34,9 ± 0,6A | 40,9 ± 6,2%a,b | 4,8 ± 0,5C |
| 50% Saccarosio-c | 32,0 ± 1,1a,b | 36,1 ± 0,5A | 28,5 ± 3,0%b,c | 5,6 ± 1,1b,c |
| 72,5% Saccarosio-c | 34,3 ± 1,8A | 36,2 ± 0,4 | 23,7 ± 3,5%C | 4,7 ± 0,9C |
| 30% Saccarosio-b | 29,4 ± 1,2b | 33,7 ± 3,1A | 43,1 ± 5,1%a | 8,6 ± 1,8A |
| 50% Saccarosio-b | 30,1 ± 1,2b | 34,9 ± 0,7A | 36,0 ± 7,2%a,b,c | 8,8 ± 1,7A |
| 72,5% Saccarosio-b | 30,9 ± 3,5a,b | 33,6 ± 3,5A | 34,0 ± 13,1%a,b,c | 7,6 ± 1,9a,b |
| ANOVA a due vie | Saccarosio: P = 0,002 | Saccarosio: P = 0.442 | Saccarosio: P < 0,001 | Saccarosio: P = 0.290 |
| Temperatura: P = 0.010 | Temperatura: P = 0.032 | Temperatura: P = 0.016 | Temperatura: P < 0.0001 | |
| Interazione: P = 0.431 | Interazione: P = 0.640 | Interazione: P = 0.441 | Interazione: P = 0.750 |
Tabella 2: e Rh in corrispondenza dei quali si verificano i massimi (Rh,max) e la lunghezza media della catena (ACL). e Rh in corrispondenza dei quali si verificano i massimi (Rh,max), β contenuto di particelle e lunghezza media della catena (ACL) del glicogeno estratto dal 30%, 50% o 72,5% di saccarosio, bollito o non bollito. -c non bollito; -b ha comportato una fase di ebollizione di 10 minuti. Le differenze nei valori con lettere in apice diverse nella stessa colonna sono statisticamente significative (P < 0,05). Questa tabella è stata riprodotta con il permesso di 21. Abbreviazioni: Rh = raggio idrodinamico; = ; ACL = lunghezza media della catena; Rh,max = Rh in corrispondenza del quale si verifica il massimo.
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Discussion
Studi precedenti hanno dimostrato che la struttura del glicogeno è importante per le sue proprietà; Ad esempio, la dimensione molecolare influisce sulla velocità di degradazione del glicogeno10 e la distribuzione della lunghezza della catena influisce sulla sua solubilità26. Per comprendere correttamente queste relazioni, è importante estrarre il glicogeno con una procedura che isoli, per quanto possibile, un campione rappresentativo e non danneggiato. I metodi tradizionali di estrazione utilizzavano condizioni alcaline calde o acide fredde. Sebbene efficaci nel separare il glicogeno da altri componenti tissutali, questi metodi sono chimicamente aggressivi e hanno dimostrato di degradare la struttura molecolare del glicogeno27.
Da allora è stato sviluppato un metodo relativamente delicato che utilizza la centrifugazione a gradiente di densitàdel saccarosio 17,18, consentendo al glicogeno di formarsi nel pellet mentre la maggior parte del materiale cellulare rimane nel surnatante. Questo metodo è particolarmente utile per il tessuto epatico, poiché le particelle di glicogeno α sono sensibili all'idrolisi acida28. Questo metodo più blando, tuttavia, ha almeno due potenziali meccanismi per l'isolamento del glicogeno che divergono nella struttura da quello osservato in vivo: 1) le particelle di glicogeno più piccole e meno dense sono più suscettibili di essere lasciate nel surnatante durante la centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio17,18, poiché potrebbero non essere in grado di raggiungere il pellet; 2) Le condizioni più miti possono consentire agli enzimi di degradazione del glicogeno, che verrebbero denaturati nelle condizioni di estrazione alcalina/acida più difficili, di continuare a degradare le particelle di glicogeno durante l'estrazione.
Una recente pubblicazione21 mirava a risolvere questi potenziali problemi testando una serie di concentrazioni di saccarosio (e quindi densità), scoprendo che l'utilizzo di una concentrazione del 30%, rispetto al 72,5% tradizionalmente utilizzato, aiutava a ridurre al minimo la perdita di particelle di glicogeno più piccole. Esperimenti futuri potrebbero testare concentrazioni ancora più basse per vedere se alcune particelle più piccole vengono ancora perse preferenzialmente nel surnatante durante la centrifugazione. Questa pubblicazione ha anche testato l'efficacia dell'introduzione di una fase di ebollizione di 10 minuti direttamente dopo l'omogeneizzazione dei tessuti per denaturare gli enzimi di degradazione del glicogeno, preservando così la struttura del glicogeno. È stato dimostrato che questo passaggio ha contribuito a inibire la degradazione del glicogeno, con la lunghezza della catena del glicogeno che è stata significativamente preservata. Ulteriori esperimenti in questo studio hanno fornito la prova che è improbabile che questa fase di ebollizione di 10 minuti causi danni significativi alla struttura del glicogeno. Tuttavia, questa fase di ebollizione può influenzare la struttura delle proteine associate al glicogeno, provocando potenzialmente la denaturazione e la successiva dissociazione delle proteine dal glicogeno. Pertanto, se la proteomica è di interesse, potrebbe essere preferibile utilizzare la bassa concentrazione di saccarosio (30%) senza ebollizione (campioni tenuti in ghiaccio), con l'avvertenza che il glicogeno potrebbe essere leggermente degradato.
Quando si utilizza la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio senza ulteriori esperimenti di ottimizzazione, il metodo più adatto consiste nell'utilizzare una concentrazione relativamente bassa di saccarosio (30%) con l'introduzione di una fase di ebollizione di 10 minuti subito dopo l'omogeneizzazione del tessuto. Ci sono alcune limitazioni a questa tecnica. In primo luogo, questo è stato ottimizzato per il glicogeno epatico ed è importante notare che potrebbe non essere così appropriato per il glicogeno di altri tessuti. In secondo luogo, come accennato in precedenza, la concentrazione più bassa di saccarosio testata è stata del 30% ed è possibile che concentrazioni più basse possano essere preferibili. In terzo luogo, non è ancora disponibile una tecnica ottimizzata che impedisca la degradazione enzimatica del glicogeno preservando il proteoma associato.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati al signor Gaosheng Wu e alla signorina Yunwen Zhu per l'assistenza tecnica con FACE e al signor Zhenxia Hu e al signor Dengbin per l'assistenza tecnica con SEC. MAS è supportato da una borsa di studio per la ricerca industriale Advance Queensland, dalla Mater Foundation, da Equity Trustees e dai trust LG McCallam Est e George Weaber. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma accademico prioritario degli istituti di istruzione superiore del Jiangsu, da una sovvenzione della Natural Science Foundation of China C1304013151101138 e dal programma di talenti per l'innovazione e l'imprenditorialità del Jiangsu del 2017. Le figure 1-5 sono state create utilizzando BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
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