片側性脳損傷は、成人の代償性神経可塑性の限界により、対側肢の永久的な機能障害を引き起こすことがよくあります10,11。以前、CC7手術が脳損傷後の成人患者の片麻痺上肢の治療に使用できることを報告しました7。脊髄前ルートを介した直接吻合両側C7神経のプロトコルの有効性を評価するために、片側性外傷性脳損傷(TBI)後のマウスで交差神経移植手術を実施しました。 図1は、TBIの手順を説明し、損傷の範囲と影響を検証しています。まず、電気皮質挫傷インパクター(eCCI)を用いて、成体マウスの左半球の大脳皮質(前後=+1.0mm〜-2.0mm、正中径=0.5mm〜3.5mm)を損傷し、片側性脳損傷を負わせた。2週間後、解剖学的構造により、このTBIプロトコルは、運動を開始するための重要な場所である感覚運動皮質をほぼ破壊することが確認されました。片側性TBIのマウスは、右前肢に重大な運動障害を認めた。 図 2 は、CC7 の手順を示しています。CC7手術の経路図から、脊髄前経路を表す経路Aが他の経路と比較して最も短いアプローチであることが明らかになりました。経路Aの長さは、左側(非麻痺側)の採取されたC7神経の長さよりもさらに短い。この発見は、神経移植手術を完了するための脊髄前ルートを選択するための解剖学的基礎を提供しました。CC7手術は、TBI後2週間で脊髄前ルートを介した直接吻合で行われました。非麻痺側の頸部7(C7)神経は、本来の脳接続を行う代わりに、麻痺側に直接移動した。 図3 は、電子顕微鏡検査の結果、移植されたC7神経が正常に再生したことを明らかにしたものです。転移したC7神経のミエリン鞘の厚さは、CC7手術後4週間から徐々に増加し、CC7手術後8週間の対照群とほぼ同等であった。 図4 は、筋電図記録を用いて、転移したC7神経の筋再神経支配を同定したものである。C7神経吻合の近位端を電気的に刺激すると、術後4週間で患部前肢の複数の筋肉に安定的に活動電位が誘導され、電子顕微鏡検査の結果と一致しました。 図5 は、コレラ毒素サブユニットB(CTB)の逆行性標識により、移植されたC7神経には、腹角からの運動線維と、健康な側の脊髄C7セグメントの後根神経節からの感覚線維が含まれていることを示しています。 図6 は、マウスモデルが片側性TBI後に有意な運動回復を示したことを示しており、臨床試験の結果と一致しています。TBI後の損傷した運動機能の回復に対するCC7手術の効果を検証するために、TBI+偽群および対照+偽群が確立されました。TBI+偽群およびTBI+CC7群のマウスは、TBI傷害に対して同時に同じ処置を受けたが、対照+偽群のマウスは偽手術のみを受けた。TBI+CC7群のマウスは神経移植手術を受けたが、TBI+偽群および対照+偽群のマウスは両側頸部7(C7)神経切除を受けた。シリンダー試験では、TBI + CC7群は、CC7手術後4週間と8週間の両方で、TBI群よりも障害のある前肢の使用率が有意に高いことを示しました(p < 0.01)。グリッド歩行試験では、TBI + CC7群は、CC7手術後4週間でTBI群よりも低いエラー率を示しました。さらに、CC7手術後8週間の時点で、TBI+CC7群のエラー率はTBI群よりも有意に低かった(p < 0.05)。これらの行動結果は、CC7手術がTBIマウスの患肢の運動機能を改善できることを示しました。これらの結果を総合すると、CC7手術によって脊髄前ルートを介して再建されたC7神経が、損傷した前肢の再生と再神経支配に成功し、片側性TBIの成体マウスの運動回復に寄与したことが示唆された。 図1:片側性外傷性脳損傷の特性評価。 (A)eCCIにおけるマウスの位置を示す模式図。(B)eCCIのパラメータと損傷範囲。(C)病変皮質を示す代表的な冠状切片(TBIの2週間後、スケールバー= 500μm)。略語:eCCI = 電気皮質挫傷インパクター。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:外科用基本図。 (a)TBIマウスにおいて対側C7神経移植を行うための実験計画を示す模式図。赤丸は外傷の位置を示す。破線の長方形内の赤い二重スラッシュは、縫合された神経を示しています。(B)断面図は、マウスにおける対側C7神経伝達の3つの代替経路を示している。経路A、青い線は、移動した神経の脊髄前経路を示しています。経路B、緑色の線は、移動した神経の気管前経路を示しています。経路Cの赤い線は、移動した神経の皮下トンネルを描いています。(C)グラフは、(B)の経路の長さと採取されたC7神経を示しています。経路Aの長さ(3.3 ± 0.10 mm)は、採取されたC7神経の長さ(4.05 ± 0.11 mm;* p < 0.05、一元配置分散分析、各群でn = 20)よりも有意に短かった。経路Cの長さ(14.15 ± 0.20 mm)は、採取されたC7神経の長さよりも有意に長かった(*** p < 0.001、一元配置分散分析、各群でn = 20)。経路Bの長さは4.2±0.08mm(n=20)であった。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:神経の断面の電子顕微鏡分析。 (A,B) 対照マウスの神経の画像。スケールバー = 5 μm (A) および 1 μm (B)。(C、D)手術後1ヶ月で再生した神経の画像。スケールバー = 5 μm(C)および1 μm(D)。(E、F)術後5ヶ月のある時点で再生した神経の画像。スケールバー = 5 μm (E) および 1 μm (F)。(G、H)術後2ヶ月で再生した神経の画像。スケールバー = 5 μm (G) および 1 μm (H)。A、C、E、Gの倍率、2,000倍。B、D、F、Hの倍率、15,000倍。(I)G比(ミエリン鞘の内径と外径の比)は、対照群のサンプルでは4週間のサンプルよりも低く、術後6〜8週間のサンプルに等しくなります(***:p < 0.001;異なるグループの軸索でのt検定との比較、n = 各グループで3匹のマウス)。略語:CC7 =対側頸部第7神経移動;CC7-XW = 術後 X 週間。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:対側のC7神経移植後の筋電図解析は、神経再生速度を示します。 (A)電子伝達刺激および 生体内 筋電図記録を示す模式図。刺激強度は試験全体を通して同じ(2mA)であった。刺激部位は、吻合部位に近位のC7神経である。(B、C)術後2週間(B)および4週間(C)に大胸筋に記録された活動電位を示す写真。(D、E)筋電図は、術後4週間(D)および8週間(E)に指伸筋に記録されました。(F)3週間で、CMAPは上腕三頭筋に出現しました。(G)4週目と8週目で、上腕三頭筋のCMAPが増加した。(H)大胸筋の平均振幅は、4週間で~0.25mV±0.16mVに達したのに対し、8週間で0.45mV±0.03mVに達し、2つの時点の間に有意差が見られた(***p<0.001、 t検定、各群でn=6)。(I)上腕三頭筋の平均振幅は、4週間で~0.15mV±0.01mVに達し、8週間で0.46mV±0.02mVに達し、2つの時点の間に有意差が見られました(***:p<0.001、 t検定、各群でn = 6)。(J)指伸筋の平均振幅は、4週間で~0.11mV±0.01mVに達したのに対し、8週間で0.29mV±0.02mVに達し、2つの時点の間に有意差が見られました(***:p<0.001、 t検定、各群でn=6)。略語:EMG =筋電図;CMAP = 複合筋活動電位。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:転移したC7神経の運動ニューロンと感覚ニューロンのCTB逆行性標識。 (A-C) CTBは、CC7手術後4週間でC7神経吻合の遠位端に注射されました。(ア)感覚ニューロンはDRG用に標識されました。(B、C)転移したC7神経の運動ニューロンは、脊髄前角について標識された。倍率、20倍。スケールバー = 200 μm (A, B);100μm(C)です。略語:CTB =コレラ毒素サブユニットB;DRG =後根神経節;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:CC7手術後の行動の変化。 (A)画像はマウスのシリンダーテストです。(B)TBIマウス(n=6匹のマウス)に対する手術後4週間および8週間後のCC7移植の効果を示す要約グラフ。p = 0.001;対応のない t検定。障害のある前肢の平均使用率は、対照+偽群で54.17%±3.01%であったのに対し、TBI+偽群では22.5%±2.14%であった。CC7手術後4週間±TBI+CC7群で35.83%2.39%であり、有意差が認められた(一元配置分散分析;p < 0.05、各群でn = 6)。CC7移行後8週間±、使用率は、対照+偽群、TBI+偽群、およびTBI+CC7群で、それぞれ53.33%3.80%、24.17%±3.01%、および40.00%±1.83%であり、有意差が認められました(*p < 0.05、一元配置分散分析、各群でn = 6)。(C)画像はグリッドウォークテストを示しています。(D)グラフは、TBI+偽群における前肢障害の平均過誤率が85.41%±1.59%(n=6)であり、TBI+CC7群の80.17%±2.19%(n=6)に等しく、対照+偽群(50.99%±11.69%)よりも高いことを示しています。術後8週間の時点で、TBI + CC7群の過誤率は76.87±1.07%(n = 6)であり、TBI+Sham群(83.06%±1.41%;p < 0.05、一元配置分散分析、各群でn = 6)よりも有意に低かった。略語:CC7 =対側頸部第7神経移動;TBI = 外傷性脳損傷。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。