Описана процедура электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрии капиллярного электрофореза для абсолютного количественного определения пирофосфатов инозитола из экстрактов клеток млекопитающих.
Пирофосфаты инозитола (PP-InsPs) являются важной группой внутриклеточных сигнальных молекул. Полученные из инозитолфосфатов (InsPs), эти молекулы характеризуются присутствием по меньшей мере одного энергичного пирофосфатного фрагмента на мио-инозитоловом кольце. Они повсеместно существуют у эукариот и действуют как метаболические мессенджеры, исследующие фосфатный гомеостаз, чувствительность к инсулину и заряд клеточной энергии. Из-за отсутствия хромофора в этих метаболитах, очень высокой плотности заряда и низкой численности, их анализ требует радиоактивного индикатора, а значит, он запутанный и дорогой. Здесь в исследовании представлен подробный протокол для выполнения абсолютного и высокопроизводительного количественного определения пирофосфатов инозитола из клеток млекопитающих с помощью масс-спектрометрии капиллярного электрофореза с электрораспылением ионизации (CE-ESI-MS). Этот метод позволяет проводить чувствительное профилирование всех биологически значимых видов PP-InsPs в клетках млекопитающих, что позволяет проводить базовое разделение региоизомеров. Представлены абсолютные клеточные концентрации PP-InsPs, включая второстепенные изомеры, и мониторинг их временных изменений в клетках HCT116 в нескольких экспериментальных условиях.
С момента первоначального открытия пирофосфатов мио-инозитола (PP-InsPs) в 1993 году 1,2 был достигнут значительный прогресс в выяснении их биосинтеза, оборота и функций 3. Пирофосфаты инозитола повсеместно встречаются в эукариотических клетках4 и служат метаболическими сигнальными молекулами, критически участвующими, например, в фосфатном гомеостазе 5,6, чувствительности к инсулину7, колебаниях кальция 8,9, везикулярном трафике10, апоптозе11, репарации ДНК12, иммунной сигнализации13 и др. Множество важных процессов под контролем пирофосфатов инозитола требует более глубокого понимания их клеточного изобилия, флуктуации и локализации.
Хотя InsPs и PP-InsPs привлекли внимание во всех дисциплинах, анализ их количества обычно выполняется с использованием метода, разработанного в 80-х годах, состоящего из маркировки клеток тритиированным инозитолом, разрешения извлеченных PP-InsPs с помощью сильной анионообменной хроматографии Sax-HPLC с последующим подсчетом сцинтилляций. Новые методы, основанные на масс-спектрометрии, по-прежнему сталкиваются со значительными проблемами: пирофосфаты инозитола с восемью фосфатными установками содержат эфиры фосфатов и ангидриды, что приводит к значительному отрицательному заряду и потенциальным потерям фосфатов во время ионизации. Существует четыре основных типа PP-InsPs, обнаруженных у млекопитающих (рисунок 1): 1,5-(PP)2-InsP4 (или 1,5-InsP8), 5-PP-InsP5 (или 5-InsP7), 1-PP-InsP5 (или 1-InsP7) и 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 (или 5-PP-InsP4)3,14. Физиологические уровни PP-InsPs обычно находятся в нано- и низкомикромолярном диапазоне, причем 5-PP-InsP5 является наиболее распространенным с клеточными концентрациями 0,5 – 5 мкм. 1,5-(PP)2-InsP 4 и 1-PP-InsP5, как полагают, составляют до 10% пула 5-PP-InsP5 и их трудно отследить во многих клетках15. 5-PP-InsP4 со свободной группой OH еще ниже по количеству и обычно обнаруживается только тогда, когда фосфатные гидролазы ингибируются фторидом натрия (NaF)16.
Высокая плотность заряда PP-InsPs затрудняет их разделение, а появление региоизомеров PP-InsP еще больше усложняет эти усилия. В результате большинство экспериментов опирались на количественное определение метаболической радиоактивной маркировкой клеток с использованием [3H]-инозитола, так как фон из матрицы исключен и высокая чувствительность достигается17,18. Однако этот метод является дорогостоящим, трудоемким и не позволяет правильно различать родственные PP-InsP региоизомеры. Кроме того, маркировка [3H]-инозитола не учитывает эндогенный синтез инозитола из глюкозы. Метод электрофореза на основе полиакриламидного геля (PAGE) является широко применяемой недорогой альтернативой, но ограниченной по своейчувствительности 19,20,21,22. Были опубликованы другие подходы, избегающие радиомаркировки, включая ионную хроматографию, за которой следует постколоночная дериватизация УФ-детектирования23, гидрофильная хроматография взаимодействия (HILIC)24 или слабый анионный обмен (WAX) в сочетании с масс-спектрометрией (MS)25. Однако они (пока) не находятся на одном уровне с классическим протоколом [3H]-инозитол SAX-HPLC.
Недавно капиллярная электрофорезная электрораспылительная масс-спектрометрия с ионизацией (CE-ESI-MS) была введена в качестве преобразующей стратегии для анализа метаболизма InsPs и PP-InsPs, отвечающей всем требованиям, рассмотренным выше16. В сочетании с современной экстракцией InsP хлорной кислотой с последующим обогащением шариками диоксида титана26, CE-ESI-MS преуспел в каждом организме, протестированном до сих пор, от дрожжей до растений и млекопитающих. Было легко достигнуто одновременное профилирование InsPs и PP-InsPs, включая все возможные региоизомеры. Внутренние стандарты со стабильной изотопной маркировкой (SIL) позволили быстро и точно дать абсолютное количественное определение, независимо от матричного воздействия. Поскольку РС может захватывать изотопные различия масс, CE-ESI-MS также может быть применен для изучения компартментированных клеточных путей синтеза InsPs и PP-InsPs, например, путем питания клеток [13C6]-мио-инозитолом или [13C6]-D-глюкозой.
Здесь описан подробный пошаговый протокол для абсолютного количественного определения PP-InsPs и InsPs из клеток млекопитающих CE-ESI-MS. Помимо основного изомера 5-PP-InsP5, в этом исследовании также количественно определены 1,5-(PP)2-InsP4 и 1-PP-InsP5, несмотря на их более низкое содержание. Изучаются две клеточные линии HCT116 из разных лабораторий (NIH, UCL), и подтверждено, что клетки HCT116UCL содержат в 7 раз более высокие уровни 1,5-(PP)2-InsP4, чем в HCT116NIH, в то время как концентрации 5-PP-InsP5 сопоставимы. Кроме того, синтез 1-PP-InsP5 в HCT116UCL достоверно не увеличивается. Также количественно изучается повышение уровня PP-InsP путем блокирования их дефосфорилирования с использованием фторида натрия.
Здесь представлен практический и чувствительный метод количественного определения высокозаряженных пирофосфатов инозитола в клетках млекопитающих. Сочетая этот подход к анализу с современной экстракцией InsP с помощью хлорной кислоты с последующим обогащением TiO2, анализ CE-ESI-MS имеет беспрецедентные преимущества. Что касается его пропускной способности, чувствительности, стабильности, абсолютного количественного определения, идентификации изомеров и зависимости от матрицы, этот метод выделяется по сравнению с другими подходами. Этот протокол применим к клеткам млекопитающих, но на самом деле эта стратегия преуспевает во многих различных образцах (например, дрожжи, растения, паразиты, ткани мыши и т. Д.).
Применяемый протокол экстракции полностью восстанавливает PP-InsPs и InsP6 из экстрактов клеток млекопитающих16,19. Он также будет извлекать многие другие анионные метаболиты, особенно фосфатсодержащие виды, например, сахарные фосфаты и нуклеотиды. Оценка восстановления и декомпозиции аналитов пользователя с помощью этого протокола будет необходима.
Как правило, система CE-ESI-MS работает бесперебойно и может вместить около 200 образцов каждую неделю с использованием этого протокола. Однако, в отличие от ВЭЖХ, СЕ долгое время рассматривалась как метод для экспертов и специализированных лиц, что ограничивало ее рынок и ограничивало ее применение. Таким образом, устройство CE-ESI-MS обычно отсутствует на аналитических факультетах. Люди, которые хотят провести анализ CE-ESI-MS, вероятно, не имеют опыта CE и будут тратить больше времени на устранение неполадок. Здесь выделены важнейшие шаги. В первую очередь это качество разреза капилляров. Чувствительность и стабильность спрея ESI в основном зависят от первоклассного капиллярного разреза. Во-вторых, капиллярный выходной конец должен находиться ровно на расстоянии 0,1 мм от наконечника опрыскивателя. Игла опрыскивателя и капилляр СЕ должны находиться в осевом направлении. Качество спрея ESI имеет решающее значение для количественного определения; для оценки повторяемости следует выполнить технические прогоны.
При описанном протоколе предел количественного определения (LOQ) для PP-InsPs составляет 40 нМ при впрыске при 50 мбар в течение 10 с (10 нЛ). Существует несколько подходов к дальнейшему повышению чувствительности метода. Во-первых, инъекция при 100 мбар в течение 20 с (40 нЛ) все равно приведет к хорошей пиковой форме и достаточному разрешению для региоизомеров 5-PP-InsP5 и 1-PP-InsP5. Во-вторых, экстракты InsP могут быть растворены в меньшем количестве воды. В-третьих, время ожидания может быть увеличено при использовании меньшего количества переходов MRM для количественного определения. Кроме того, источник ионов CE-MS, использующий поток жидкости со сверхнизкой оболочкой, значительно повысит чувствительность.
Работающий буфер CE с pH 9 обеспечивает наилучшее разрешение между InsP 6-InsP8. При повышении pH до 9,7 разрешение среди InsP 3-InsP6 значительно улучшится. Благодаря отличному разрешению для дальнейшего увеличения пропускной способности рекомендуется более короткая длина капилляра 72 см. Кроме того, более высокая температура кассеты CE при 40 °C снижает вязкость водного электрофоретического буфера и ускоряет их движение под EOF. В соответствии с различными исследовательскими требованиями модификации этого метода могут дополнительно облегчить анализ InsPs и PP-InsPs. Таким образом, описанные протоколы CE-ESI-MS могут открыть новые возможности для исследований в этом многогранном семействе сигнальных молекул.
The authors have nothing to disclose.
Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 864246, HJJ). DQ признает финансовую поддержку со стороны Программы Бригитты-Шлибен-Ланге. AS поддерживается грантом программы MRC MR/T028904/1.
Materials | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | – |
15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | – |
2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | – |
50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | – |
96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
T75 flasks | TPP | 90076 | – |
Chemicals and Reagents | |||
NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | – |
Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
PBS | Gibco | 10010015 | – |
Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | – |
TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
Equipment | |||
Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
CE system | Agilent | G7100A | – |
CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | – |
CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | – |
Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
ESI source | Agilent | AJS ESI | – |
Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
Ice box | – | – | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | – |
Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
Software | |||
MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | – |
QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | – |