这是一种适应方法,用于识别 伯克霍尔德里亚 有益共生的候选昆虫殖民因子。甲虫宿主感染了通过转波突变产生的随机突变库,殖民化后的库复杂性被比作 体外生长的对照。
通过操纵基因的活动来推断基因的功能是理解大多数生物过程的遗传基础的重要工具。分子微生物学的进步见证了各种突变技术的出现,用于基因的操纵。其中,转波子插入测序(Tn-seq)是一个有价值的工具,可以同时以非目标的方式评估许多候选基因的功能。该技术是确定几个致病微生物和几个有益共生体中真核宿主殖民化的分子机制的关键。
在这里,Tn-seq被确定为一种方法,以确定殖民因素在共同的伯克霍尔德里亚角斗士共生甲虫拉格里亚维洛萨。通过结合,Tn5转波介导插入抗生素耐药盒是在B.格拉迪奥利的随机基因组位置进行的。为了确定基因破坏对细菌殖民甲虫宿主的能力的影响,生成的B.角质变异库在甲虫卵上接种,而控制在液体培养介质中体外生长。在留出足够的时间进行殖民化后,DNA从体内和体外生长的库中提取。根据DNA库准备协议,DNA样本为转波子插入测序做好准备。选择包含转波插入边缘和侧翼细菌DNA的DNA片段,突变位点通过从转波插入边缘进行测序确定。最后,通过分析和比较体内和体外库之间每个突变体的频率,可以预测甲虫殖民化期间特定共生基因的重要性。
伯克霍尔德里亚角斗士可以与拉格里亚维洛萨甲虫进行共生关联,在防御昆虫宿主4、5、6的微生物拮抗剂方面发挥重要作用。雌性甲虫在生殖系统的专门腺体中容纳了几株B.角质。产卵后,雌性在蛋表面涂抹B.角膜细胞,其中B.角蛋白产生的抗菌化合物通过致病真菌4、6抑制感染。在胚胎发育后期或幼虫孵化后的早期,细菌在幼虫的腹腔表面殖民性脑腔入侵。尽管有这种专门的本地化和垂直传输路线的共生,L.维洛萨大概也可以从环境4水平获得B.格拉迪奥利。此外,至少发现了三株B.格拉迪奥利与L.维洛萨4,6。其中,B.格拉迪奥利Lv-StA是唯一一个是适应体外培养。
B. 格拉迪奥利Lv-StA的基因组大小为8.56Mb6,包含7,468个基因。这些基因中哪些对B.角质细菌殖民甲虫宿主很重要?为了回答这个问题,我们使用转波插入测序(Tn-seq),一种探索性的方法来识别有条件的基本微生物基因1,2,3。使用 Tn5 转子创建了B. 格拉迪奥利Lv – sta 的突变库。通过从大肠杆菌捐献细胞到B.格拉迪奥利Lv-StA的结合,转移了携带Tn5转波子的pRL27质粒和一个抗生素耐药盒,旁边是倒置重复(图1)。由此产生了一组单独携带3,736个共生基因中断的突变体(图2)。
突变池被感染到甲虫卵上,以确定殖民化因素,并且,作为一种控制,也生长 在国王 的B(KB)介质体外。在留出足够的时间进行殖民化后,将孵化的幼虫收集并汇集起来进行DNA提取。使用经过修改的DNA库准备程序进行测序,选取了包含转波子插入物的DNA片段和 B.格拉迪奥利 Lv-StA侧翼基因组区域。阅读质量处理,然后与DESeq2进行分析,以确定特定的基因,关键 B.格拉迪奥利 Lv-STA殖民 L.维洛萨 幼虫时,通过蛋表面传播。
生成了 B.角膜 突变库,以识别 L.维洛萨 甲虫和 B.角膜 菌共生相互作用中重要的宿主殖民因子。协议中的主要步骤是结合、宿主感染、DNA库准备和测序。
由于许多菌株的伯克霍尔德里亚是适应基因改造的结合24,25,质粒携带转波子和抗生素插入盒成功地结合到目标B.格拉迪奥利Lv-StA菌株从大肠杆菌。以前通过电电转换的尝试产生非常低到几乎没有B.角斗士变压剂。建议优化目标生物体的转化技术,以有效产生大量的转化剂。
一轮结合和40个结合点打乱了 B.格拉迪奥利 Lv-StA的3,736个基因。事后看来,要破坏7,468个基因中的大多数,并获得饱和库,需要多轮结合。值得注意的是,在结合期间的孵化时间不允许超过12-18小时,这是 B.gladioli指数增长阶段的结束。允许在细菌细胞的指数生长阶段之外进行结合,可以降低成功获得转相体26的机会。因此,结合期应根据细菌物种的生长情况进行调整。
要成功地进行一项涉及宿主中突变库感染的实验,重要的是要评估殖民化期间的细菌种群瓶颈大小和感染前库中突变体的多样性。在准备实验时,我们估计了必须感染的甲虫的最小数量,以便对库中的每个突变体进行采样并允许殖民的可能性很高。还计算了活体细菌生成时间的近似值和实验期间的代数。体外文化通过调整孵化时间,成长为可比的几代人。对于其他非模型宿主的类似感染实验,维持实验室培养和宿主生物源的能力是可取的。
随着变异库 在体内 、 体外 和样本采集中的发展,进行了变异体插入测序的DNA库准备方案的修改。协议中的修改包括设计自定义 PCR 引物并添加 PCR 步骤,以选择包含插入盒式磁带的 DNA 片段。由于协议是定制的,协议中额外的 PCR 周期增加了过度放大的风险,并在最终库中获取杂交适配器适配器片段。因此,建议在两个 PCR 之后进行最后的清理步骤(无尺寸选择),因为它有助于删除这些片段。DNA库的规模分布仍然比预期的要广。然而,增加测序深度提供了在生物信息学分析过程中过滤的足够数据,取得了令人满意的结果。
由于转波介导突变在单个实验中产生数千个随机插入,因此有可能生成一个饱和突变体库,其中包含除那些对细菌生长至关重要的基因被破坏的突变体以外的所有突变体。我们很可能没有与饱和突变库合作,因为在关于伯克霍尔德里亚sp的其他研究中,我们估计了基本基因。28,29.然而,一个非饱和图书馆有助于探索各种候选基因,以便使用靶向突变进行进一步研究。在实验之前,还必须记住,一些转位子有特定的插入目标位点,在基因组30的某些位点增加突变体的丰度。水手转位器已知瞄准AT站点插入31,和Tn5转子有GC偏置32,33。包括生物信息学分析期间识别转电体插入热点的步骤,将有助于评估任何分布偏差。
虽然容易受挫,但精心设计的转波子插入测序实验可以成为在单个实验中识别细菌中许多具有条件重要基因的有力工具。例如,通过结合转波子突变和基因组学34,在伯克霍尔德里亚半纳利斯的十几个基因对抑制兰叶坏死非常重要。除了伯克霍尔德里亚,一些粘附和动感基因和运输器已被确定为重要的殖民因素在斯诺德格拉塞拉阿尔维共生阿皮斯梅利费拉(蜜蜂)22,并在维布里奥菲舍里共生欧普林纳牛皮(夏威夷波尾鱿鱼)23使用跨波森插入突变方法。
作为另一种方法,转体突变后,可以使用选择性介质而不是测序来筛查单个突变体。表型筛查或生物测定,以识别缺陷,如运动性,生产生物活性二次代谢物,或特定的辅助物,是可行的。例如,筛选一个 伯克霍尔德里亚昆虫 库(重新分配给卡 巴列罗尼亚属35)变异库是确定共生体使用动能基因殖民 里普托图斯小虫的关键,他们的昆虫宿主36。此外,利用转波突变和表型筛查,在 伯克霍尔德里亚卡约菲利37中发现了生物活性二次代谢性肌蛋白的生物合成基因簇。在转体突变和筛查后,发现了 一种伯克霍尔德里亚伪多马雷 的辅助营养变异体,并且是一种可能衰减的疫苗候选者,可以预防甲状腺病,这是一种在人类和动物中的危险疾病。因此,转波子突变和测序是研究细菌分子特征的宝贵方法,这些分子特征对于在致病性或相互关联中与各自宿主的相互作用非常重要。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢李俊波在手术过程中提供 大肠杆菌 WM3064+pRL27菌株的结合和指导,感谢凯瑟琳·霍夫迈尔在突变图书馆生成过程中帮助故障排除,感谢安德烈·罗德里格斯教授支持昆虫收集和许可获取。我们还感谢雷贝卡·扬克和达格玛·克莱布施在昆虫的收集和饲养方面给予的支持。我们感谢巴西当局为昆虫标本的获取、收集和出口颁发下列许可证:SISBIO 授权 Nr. 45742-1、45742-7 和 45742-10, CNPq 流程 no 01300.004320/2014-21 和 01300.0013848/2017-33,IBAMA Nr. 14BR016151DF 和 20BR035212/DF)。这项研究得到了德国科学基金会(DFG)研究补助金FL1051/1-1和KA2846/6-1资助。
2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
Agar – Agar | Roth | 5210 | |
Agarose | Biozym | 840004 | |
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
Glycerol | Roth | 7530 | |
K2HPO4 | Roth | P749 | |
Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
KCl | Merck | 4936 | |
KH2PO4 | Roth | 3904 | |
MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
Na2HPO4 | Roth | P030 | |
NaCl | Merck | 6404 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
Petri plates – 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
Petri plates – 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
Yeast extract | Roth | 2363 |