Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi
Summary
Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.
Abstract
İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri biyolojik süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Optogenetik ekspresyon sistemleri, indükleyici madde olarak ışığı kullanarak gen ekspresyon zamanlaması, konumu ve genliği üzerinde hassas kontrol sağlayabilir. Bu protokolde zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik bir ifade sistemi kullanılmaktadır. Bu sistem, E. litoralisbakterisinden doğal olarak meydana gelen ışıkla aktive edilmiş transkripsiyon faktörüne dayanan TAEL adı verilen tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüne dayanır. Mavi ışıkla aydınlatıldığında TAEL küçültür, C120 adı verilen konyak düzenleyici elemanına bağlanır ve transkripsiyonu etkinleştirir. Bu protokol, her yerde bulunan ubb promotörünün kontrolü altında TAEL transkripsiyon faktörünü ifade eden transgenik zebra balığı embriyolarını kullanır. Aynı zamanda, C120 düzenleyici elemanı floresan bir muhabir geninin (GFP) ekspresyonunu yönlendirir. Mavi ışığı etkinleştirmek için basit bir LED panel kullanarak, GFP ekspresyonunun indüksiyonu ilk olarak 30 dakikalık aydınlatmadan sonra tespit edilebilir ve 3 saatlik ışık işleminden sonra 130 kat indüksiyondan daha yüksek bir tepeye ulaşır. Ekspresyon indüksiyonu nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve floresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem optogenetik gen ekspresyasyonu için çok yönlü ve kullanımı kolay bir yaklaşımdır.
Introduction
İndükleyici gen ekspresyon sistemleri gen ekspresyonunun miktarını, zamanlamasını ve yerini kontrol etmeye yardımcıdır. Bununla birlikte, çok hücreli organizmalarda tam olarak mekansal ve zamansal kontrole ulaşmak zor olmuştur. Zamansal kontrol en yaygın olarak küçük moleküllü bileşikler1 veya ısı şoku organizatörlerinin aktivasyonu ile elde edilir2. Yine de, her iki yaklaşım da zamanlama, indüksiyon gücü ve hedef dışı stres yanıtları sorunlarına karşı savunmasızdır. Mekansal kontrol esas olarak dokuya özgü promotörlerin kullanılmasıyla elde edilir3, ancak bu yaklaşım her zaman mevcut olmayan uygun bir promotör veya düzenleyici eleman gerektirir ve alt doku seviyesi indüksiyonu için elverişli değildir.
Bu tür geleneksel yaklaşımların aksine, ışıkla aktive edilmiş optogenetik transkripsiyonel aktivatörler gen ekspresyonunun daha ince uzamsal ve zamansal kontrolü potansiyeline sahiptir4. Mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemi zebra balığı embriyolarında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve optimize edilmiştir5,6. Bu sistem, E. litoralis7,8bakterisinden endojen ışıkla aktive edilmiş bir transkripsiyon faktörüne dayanmaktadır. TAEL/C120 sistemi, Kal-TA4 transaktivasyon etki alanı, mavi ışığa duyarlı LOV (ışık-oksijen-voltaj algılama) etki alanı ve sarmal dönüş sarmal (HTH) DNA bağlayıcı etki alanı5içeren TAEL adlı transkripsiyonel bir aktivatörden oluşur. Aydınlatıldığında, LOV etki alanları, iki TAEL molekülünün küçültmesine, TAEL duyarlı bir C120 promotörüne bağlanmasına ve ilgi çekici bir aşağı akış geninin transkripsiyonunu başlatmasına izin veren konformasyonel bir değişikliğe uğrar5,8. TAEL/C120 sistemi minimum toksisite ile hızlı ve sağlam indüksiyon sergiler ve birkaç farklı ışık dağıtım yöntemi ile etkinleştirilebilir. Son zamanlarda, TAEL/C120 sisteminde iyileştirmeler, TAEL’e (TAEL-N) nükleer bir yerelleştirme sinyali eklenerek ve C120 düzenleyici elemanı bir cFos bazal promotörüne (C120F) kaptırarak yapılmıştır (Şekil 1A). Bu değişiklikler indüksiyon seviyelerini 15 kattan fazla artırdı6.
Bu protokolde, TAEL/C120 sistemini etkinleştirmek ve bir muhabir geni olan GFP’nin her yerde ifadesini teşvik etmek için basit bir LED panel kullanılır. Ekspresyon indüksiyonu, floresan yoğunluğu gözlemlenerek veya nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak transkript seviyeleri ölçülerek nitel olarak izlenebilir. Bu protokol, TAEL/C120 sistemini, genekspresyonunun in vivo olarak sağlam bir şekilde düzenlenmesini sağlayan çok yönlü, kullanımı kolay bir araç olarak gösterecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, mavi ışık indüklüze gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik TAEL/C120 sisteminin kullanımını açıklar. Bu sistem, mavi ışıkla aydınlatıldıktan sonra küçülen ve bir C120 düzenleyici elemanının aşağı akışa giren bir ilgi geninin transkripsiyonunu etkinleştiren transkripsiyonel bir aktivatör olan TAEL’den oluşur. Bir GFP muhabirinin indüklenmiş ifadesi, 30 dakika kadar kısa bir ışık maruziyeti sonrasında tespit edilebilir, bu da bu yaklaşımın nispeten hızlı ve du…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stefan Materna’ya ve Woo ve Materna laboratuvarlarının üyelerine bu protokolle ilgili yararlı öneriler ve yorumlar için teşekkür ederiz. Anna Reade, Kevin Gardner ve Laura Motta-Mena’ya bu protokolü geliştirirken değerli tartışmalar ve içgörüler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin (NIH; R03 DK106358) ve Kaliforniya Üniversitesi Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (CRN-20-636896) ‘a S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
Referências
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Bioquímica. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).
