Lichtinduzierte GFP-Expression in Zebrafischembryonen mit dem optogenetischen TAEL/C120-System
Summary
Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug mit vielfältigen Anwendungen. Dieses Protokoll zeigt, wie eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen mit dem blaulichtempfindlichen TAEL/C120-System erreicht werden kann.
Abstract
Induzierbare Genexpressionssysteme sind ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung biologischer Prozesse. Optogenetische Expressionssysteme können eine präzise Kontrolle über das Timing, den Ort und die Amplitude der Genexpression mit Licht als induzierendem Mittel ermöglichen. In diesem Protokoll wird ein optogenetisches Expressionssystem verwendet, um eine lichtinduzierbare Genexpression in Zebrafischembryonen zu erreichen. Dieses System basiert auf einem künstlichen Transkriptionsfaktor namens TAEL, der auf einem natürlich vorkommenden lichtaktivierten Transkriptionsfaktor des Bakteriums E. litoralisbasiert. Bei blauer Beleuchtung dimerisiert TAEL, bindet an sein verwandtes regulatorisches Element namens C120 und aktiviert die Transkription. Dieses Protokoll verwendet transgene Zebrafischembryonen, die den TAEL-Transkriptionsfaktor unter der Kontrolle des allgegenwärtigen Ubb-Promotors exprimieren. Gleichzeitig treibt das regulatorische Element C120 die Expression eines fluoreszierenden Reportergens (GFP) an. Mit einem einfachen LED-Panel zur Abgabe von aktivierendem blauem Licht kann die Induktion der GFP-Expression erst nach 30 Minuten Beleuchtung erkannt werden und erreicht nach 3 Stunden Lichtbehandlung einen Höhepunkt von mehr als 130-facher Induktion. Die Expressionsinduktion kann mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) und fluoreszenzmikroskopischer Mikroskopie beurteilt werden. Diese Methode ist ein vielseitiger und einfach zu bedienender Ansatz für die optogenetische Genexpression.
Introduction
Induzierbare Genexpressionssysteme helfen, die Menge, den Zeitpunkt und den Ort der Genexpression zu kontrollieren. Es war jedoch eine Herausforderung, eine genaue räumliche und zeitliche Kontrolle in mehrzelligen Organismen zu erreichen. Die zeitliche Kontrolle wird am häufigsten durch Zugabe von niedermolekularen Verbindungen1 oder Aktivierung von Hitzeschockpromotoren2erreicht. Dennoch sind beide Ansätze anfällig für Probleme des Timings, der Induktionsstärke und der Stressreaktionen außerhalb des Ziels. Die räumliche Kontrolle wird hauptsächlich durch die Verwendung von gewebespezifischen Promotorenerreicht 3, aber dieser Ansatz erfordert einen geeigneten Promotor oder ein regulatorisches Element, die nicht immer verfügbar sind, und es ist nicht förderlich für die Induktion auf Untergewebeebene.
Im Gegensatz zu solchen herkömmlichen Ansätzen haben lichtaktivierte optogenetische Transkriptionsaktivatoren das Potenzial für eine feinere räumliche und zeitliche Kontrolle der Genexpression4. Das blaulichtempfindliche TAEL/C120-System wurde für den Einsatz in Zebrafischembryonen5,6entwickelt und optimiert. Dieses System basiert auf einem endogenen lichtaktivierten Transkriptionsfaktor aus dem Bakterium E. litoralis7,8. Das TAEL/C120-System besteht aus einem Transkriptionsaktivator namens TAEL, der eine Kal-TA4-Transaktivierungsdomäne, eine blaulichtempfindliche LOV-Domäne (Light-Oxygen-Voltage Sensing) und eine Helix-Turn-Helix (HTH) DNA-Bindungsdomäne5enthält. Wenn sie beleuchtet werden, durchlaufen die LOV-Domänen eine Konformationsänderung, die es zwei TAEL-Molekülen ermöglicht, zu dimerisieren, an einen TAEL-responsiven C120-Promotor zu binden und die Transkription eines nachgeschalteten Gens von Interesseeinzuleiten 5,8. Das TAEL/C120-System weist eine schnelle und robuste Induktion mit minimaler Toxizität auf und kann durch verschiedene Lichtabgabemodalitäten aktiviert werden. Vor kurzem wurden Verbesserungen am TAEL/C120-System vorgenommen, indem ein nukleares Lokalisierungssignal zu TAEL (TAEL-N) hinzugefügt und das C120-Regulationselement an einen cFos-Basalpromotor (C120F) gekoppelt wurde(Abbildung 1A). Diese Modifikationen verbesserten die Induktion um mehr als das 15-fache6.
In diesem Protokoll wird ein einfaches LED-Panel verwendet, um das TAEL / C120-System zu aktivieren und die allgegenwärtige Expression eines Reportergens, GFP, zu induzieren. Die Expressionsinduktion kann qualitativ durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität oder quantitativ durch Messung der Transkriptspiegel mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) überwacht werden. Dieses Protokoll wird das TAEL/C120-System als vielseitiges, einfach zu bedienendes Werkzeug demonstrieren, das eine robuste Regulierung der Genexpression in vivoermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des optogenetischen TAEL/C120-Systems, um eine blaulichtinduzierbare Genexpression zu erreichen. Dieses System besteht aus einem Transkriptionsaktivator, TAEL, der bei Beleuchtung mit blauem Licht dimerisiert und die Transkription eines Gens von Interesse nach einem C120-Regulationselement aktiviert. Die induzierte Expression eines GFP-Reporters kann bereits nach 30 Minuten Lichteinwirkung nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz eine relativ schnelle und re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Stefan Materna und den Mitgliedern der Woo- und Materna-Labore für hilfreiche Anregungen und Kommentare zu diesem Protokoll. Wir danken Anna Reade, Kevin Gardner und Laura Motta-Mena für wertvolle Diskussionen und Einblicke bei der Entwicklung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) und das University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) an S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
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