Ljusinducerat GFP-uttryck i zebrafiskembryon med optogenetisk TAEL/C120-system
Summary
Optogenetik är ett kraftfullt verktyg med omfattande applikationer. Detta protokoll visar hur man uppnår ljus-inducerbara genuttryck i zebrafiskembryon med hjälp av det blå ljuskänsliga TAEL/C120-systemet.
Abstract
Inducerbara genuttryckssystem är ett ovärderligt verktyg för att studera biologiska processer. Optogenetiska uttryckssystem kan ge exakt kontroll över genuttryck timing, plats och amplitud med hjälp av ljus som inducerande medel. I detta protokoll används ett optogenetiskt uttryckssystem för att uppnå ljusinducerbara genuttryck i zebrafiskembryon. Detta system förlitar sig på en konstruerad transkriptionsfaktor som kallas TAEL baserat på en naturligt förekommande ljusaktiverad transkriptionsfaktor från bakterien E. litoralis. När TAEL belyses med blått ljus dimerizes, binder till dess cognate reglerande element som kallas C120 och aktiverar transkription. Detta protokoll använder transgena zebrafiskembryon som uttrycker TAEL-transkriptionsfaktorn under kontroll av den allestädes närvarande ubbpromotorn. Samtidigt driver C120-regleringselementet uttrycket av en fluorescerande reportergen (GFP). Med hjälp av en enkel LED-panel för att leverera aktiverande blått ljus kan induktion av GFP-uttryck först detekteras efter 30 minuters belysning och når en topp på mer än 130-faldig induktion efter 3 h ljusbehandling. Uttryck induktion kan bedömas genom kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR) och genom fluorescensmikroskopi. Denna metod är en mångsidig och lättanvänd metod för optogenetiska genuttryck.
Introduction
Inducerbara genuttryckssystem hjälper till att kontrollera mängden, tidpunkten och platsen för genuttrycket. Att uppnå exakt rumslig och tidsmässig kontroll i multicellulära organismer har dock varit utmanande. Temporal kontroll uppnås oftast genom att tillsätta småmolekylföreningar1 eller aktivering av värmechockpromotors2. Ändå är båda metoderna sårbara för frågor om timing, induktionsstyrka och stressrespons utanför målet. Rumslig kontroll uppnås främst genom användning av vävnadsspecifikapromotors 3, men detta tillvägagångssätt kräver en lämplig promotor eller regleringselement, som inte alltid är tillgängliga, och det bidrar inte till induktion på subvävnadsnivå.
I motsats till sådana konventionella metoder har ljusaktiverade optogenetiska transkriptionsaktivatorer potential för finare rumslig och tidsmässig kontroll av genuttryck4. Det blå ljuskänsliga TAEL/C120-systemet utvecklades och optimerades för användning i zebrafiskembryon5,6. Detta system är baserat på en endogen ljusaktiverad transkriptionsfaktor från bakterien E. litoralis7,8. TAEL/C120-systemet består av en transkriptionsaktivator som kallas TAEL som innehåller en Kal-TA4-transaktiveringsdomän, en blå ljusresponsiv LOV-domän (ljus-syrespänningsavkänning) och en helix-turn-helix (HTH) DNA-bindande domän5. När LOV-domänerna belyses genomgår de en konformationsförändring som gör det möjligt för två TAEL-molekyler att dimrisera, binda till en TAEL-responsiv C120-promotor och initiera transkription av en nedströmsgen av intresse5,8. TAEL/C120-systemet uppvisar snabb och robust induktion med minimal toxicitet, och det kan aktiveras av flera olika ljustillförselsätt. Nyligen gjordes förbättringar av TAEL/C120-systemet genom att lägga till en kärnlokaliseringssignal till TAEL (TAEL-N) och genom att koppla C120-regleringselementet till en cFos basalpromotor (C120F) (figur 1A). Dessa modifieringar förbättrade induktionsnivåerna med mer än 15 gånger6.
I det här protokollet används en enkel LED-panel för att aktivera TAEL/C120-systemet och inducera det allestädes närvarande uttrycket av en reportergen, GFP. Uttrycksinduktion kan övervakas kvalitativt genom att observera fluorescensintensitet eller kvantitativt genom att mäta transkriptionsnivåer med kvantitativ PCR i realtid (qRT-PCR). Detta protokoll kommer att visa TAEL/ C120-systemet som ett mångsidigt, lättanämt verktyg som möjliggör robust reglering av genuttryck in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver användningen av det optogenetiska TAEL/C120-systemet för att uppnå blå ljusinducerbara genuttryck. Detta system består av en transkriptionell aktivator, TAEL, som dimerizes vid belysning med blått ljus och aktiverar transkription av en gen av intresse nedströms ett C120-regleringselement. Inducerad uttryck av en GFP-reporter kan upptäckas efter så lite som 30 minuters ljusexponering, vilket tyder på att detta tillvägagångssätt har relativt snabb och lyhörd kinetik.
<p class="jo…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Stefan Materna och medlemmar i Woo och Materna labs för hjälpsamma förslag och kommentarer om detta protokoll. Vi tackar Anna Reade, Kevin Gardner och Laura Motta-Mena för värdefulla diskussioner och insikter samtidigt som vi utvecklar detta protokoll. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) och University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) till S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
Referências
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Bioquímica. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).
