Seriell Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) tillämpas på bild och analysera dendritiska ryggrader i murine hippocampus.
Tredimensionell elektronmikroskopi (3D EM) ger möjlighet att analysera morfologiska parametrar för dendritiska ryggrader med nanoskalaupplösning. Dessutom kan vissa funktioner i dendritiska ryggraden, såsom ryggradens volym och postsynaptisk densitet (PSD) (som representerar postsynaptisk del av synapsen), närvaro av presynaptisk terminal och slät endoplasmisk retikulum eller atypisk form av PSD (t.ex. multi-innervated spines), observeras endast med 3D EM. Genom att använda seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBEM) är det möjligt att få 3D EM-data enklare och på ett mer reproducerbart sätt än vid utförandet av traditionell seriell sektionering. Här visar vi hur man förbereder mus hippocampal prover för SBEM analys och hur detta protokoll kan kombineras med immunofluorescens studie av dendritiska ryggraden. Mild fixering perfusion gör det möjligt för oss att utföra immunofluorescens studier med lätt mikroskopi på ena halvan av hjärnan, medan den andra hälften var beredd på SBEM. Detta tillvägagångssätt minskar antalet djur som ska användas för studien.
De flesta excitatoriska synapserna i centrala nervsystemet ligger på dendritiska ryggrader – små utskjutningar av ett neuronalt membran. Dessa utskjutningar bildar begränsade biokemiska fack som styr intracellulär signaltransduktion. Strukturell plasticitet av dendritiska ryggrader och synapser är nära besläktad med de funktionella förändringarna i synaptisk effekt som ligger till grund för sådana viktiga processer somlärande och minne 1,2. Det är viktigt att notera att elektronmikroskopi (EM) är den enda tekniken som gör det möjligt att avgöra om en dendritisk ryggrad har en presynaptisk ingång. EM-upplösning behövs också för att studera strukturella detaljer såsom form av en postsynaptisk densitet (PSD), som representerar en postsynaptisk del av en synaps eller dimensioner av en dendritisk ryggrad, liksom storleken och formen på en axonal bouton. Dessutom är det möjligt att visualisera synapser och deras omgivning med EM.
Tack vare framsteg inom bild- och datateknik är det möjligt att rekonstruera hela neurala kretsar. Volymelektronmikroskopitekniker, såsom seriell sektionsöverföringselektronmikroskopi (ssTEM), seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBEM) och fokuserad jonstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) används ofta för neuronala kretsrekonstruktioner3.
I våra studier används SBEM-metoden framgångsrikt för att undersöka den strukturella plasticiteten hos dendritiska ryggrader och PSDs i prover av musen hippocampus och organotypiska hjärnskivor 4,5. SBEM är baserad på installationen av en miniatyr ultramicrotome inuti scanning elektronmikroskopkammaren6,7,8,9. Toppen av provblocket avbildas, och sedan skärs provet på ett angivet djup av ultramicrotome, vilket avslöjar en ny block-face, som återigen avbildas och sedan upprepasprocessen 8. Som ett resultat är det bara bilden av ett block-ansikte kvar medan skivan som har skurits går förlorad som skräp. Det är därför SBEM kallas en destruktiv teknik, vilket innebär att det inte är möjligt att avbilda samma plats igen. Fördelen med de destruktiva blockeringsmetoderna är dock att de inte lider av warpingproblem och sektionsförlust som avsevärt kan påverka datakvaliteten och dataanalysen3. Dessutom ger SBEM möjlighet att avbilda ett relativt stort synfält (> 0,5 mm × 0,5 mm) vid hög upplösning3.
För att använda SBEM måste prover förberedas enligt ett dedikerat, mycket kontrasterande protokoll på grund av den backscattered elektrondetektorn som används för att förvärva bilder. Vi visar här hur man utför provberedning enligt protokollet baserat på ett förfarande utvecklat av Deerinck10 (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metod), med hjälp av reducerade osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) fläckar som utvecklats på 1980-talet8,11. Dessutom introducerar vi en tvåstegs fixeringsmetod, med mild fixering perfusion som gör det möjligt att använda samma hjärna både för immunofluorescensstudier med lätt mikroskopi och SBEM.
I protokollet är en mushjärna främst fixerad med ett milt fixativ och skärs sedan i halvor, och en halvklot postfixeras och förbereds för immunofluorescens (IF), medan den andra för EM-studier (Figur 1).
Figur 1. Schematisk representation av arbetsflödet för dendritiska ryggraden förberedelse för analysen med SBEM. Möss offrades och perfused med en mild primära fixativ. Hjärnan var skuren i halvor, och en halvklot postfixerades med immunofluorescens (IF)-dedikerade fixativ, cryoprotected, skivas med en cryostat och bearbetades för IF studier, medan den andra halvklotet var postfixed med EM fixativ, skivas med vibratome och beredd för EM studier. Hjärnskivor för SBEM-studier kontrasterades, platt inbäddad i harts, sedan monterades en CA1-region i hippocampus på stiftet och avbildades med SBEM (Figur 1). Den del av protokollet som markerats i en gul ruta presenterades i videon. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Det finns många variationer av den primära NCMIR-metoden som beskrivs av Deerinck 201010. De grundläggande principerna förblir desamma, men beroende på vilken typ av material som studeras genomförs små förändringar. Det beskrevs tidigare att olika hartser kan användas för att bädda in exemplar för SBEM och till exempel när det gäller växter är Spurrs det resin som valdes på grund av dess låga viskositet som möjliggör bättre infiltration genom cellväggarna22…
The authors have nothing to disclose.
SBEM imaging, ljusmikroskopi imaging och elektronmikroskopi provberedning utfördes med hjälp av utrustningen från Laboratory of Imaging Tissue and Function som fungerar som en bildkärna anläggning vid Nencki Institute of Experimental Biology.
För förberedelse av figur 1 användes bilden av en mus (Souris_02) och en flaska https://smart.servier.com/ beredningen.
Detta arbete stöddes av National Science Centre (Polen) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) som tilldelades KR.
Anesthetic: | |||
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Fixatives: | |||
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
Perfusion: | |||
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
Brain slices preparation for EM: | |||
12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
Brain slices preparation for IF: | |||
96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
Immunostaining: | |||
24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
Electron microsocpy sample preparation | |||
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
Specimen mounting for SBEM | |||
96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
Software | webpage | tutorials | |
FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
Animals | |||
Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |