सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM) को मूर्ति पर लागू किया जाता है और मुरीन हिप्पोकैम्पस में डेंड्रिटिक कताई का विश्लेषण किया जाता है।
त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (3 डी ईएम) नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ डेंड्रिटिक कताई के रूपात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने की संभावना देता है। इसके अलावा, डेंड्रिटिक कताई की कुछ विशेषताएं, जैसे कि रीढ़ की मात्रा और पोस्ट-सिनैप्टिक घनत्व (PSD) (सिनैप्स के पोस्ट-सिनेप्टिक भाग का प्रतिनिधित्व करना), प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल की उपस्थिति, और पीएसडी (जैसे, बहु-इनरवेटेड कताई) का चिकनी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम या असामान्य रूप, केवल 3 डी ईएम के साथ देखा जा सकता है। धारावाहिक ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीईएम) को नियोजित करके पारंपरिक धारावाहिक अनुभागिंग करने की तुलना में 3डी ईएम डेटा आसान और अधिक प्रजनन तरीके से प्राप्त करना संभव है। यहां हम दिखाते हैं कि SBEM विश्लेषण के लिए माउस हिप्पोकैम्पल नमूने कैसे तैयार करें और इस प्रोटोकॉल को डेंड्रिटिक कताई के इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के साथ कैसे जोड़ा जा सकता है। हल्के निर्धारण परफ्यूजन हमें मस्तिष्क के एक आधे हिस्से पर हल्के माइक्रोस्कोपी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन करने की अनुमति देता है, जबकि दूसरा आधा SBEM के लिए तैयार किया गया था। इस दृष्टिकोण से अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले जानवरों की संख्या कम हो गई है ।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अधिकांश उत्तेजक सिनेप्स डेंड्रिटिक कताई पर स्थित होते हैं – एक न्यूरोनल झिल्ली के छोटे फलाव। ये फलाव जैव रासायनिक डिब्बों को सीमित करते हैं जो इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसडक्शन को नियंत्रित करते हैं। डेंड्रिटिक कताई और सिनैप्स की संरचनात्मक प्लास्टिसिटी का सिनैप्टिक प्रभावकारिता में कार्यात्मक परिवर्तनों से गहरा संबंध है जो सीखने और स्मृति1,2के रूप में ऐसी महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) एकमात्र तकनीक है जो यह निर्धारित करने की अनुमति देती है कि क्या एक डेंड्रिटिक रीढ़ में प्रेसिनैप्टिक इनपुट है। ईएम संकल्प को अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों जैसे कि एक पोस्टसिनैप्टिक घनत्व (पीएसडी) के आकार का अध्ययन करने की भी आवश्यकता है, जो एक सिनेप्स के एक पोस्टसिनैप्टिक भाग का प्रतिनिधित्व करता है, या एक डेंड्रिटिक रीढ़ के आयामों के साथ-साथ एक अक्षीय मुक्केबाज़ी के आकार और आकार का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अतिरिक्त, ईएम के साथ सिनेप्स और उनके परिवेश की कल्पना करना संभव है।
इमेजिंग और कंप्यूटिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति के लिए धन्यवाद, पूरे तंत्रिका सर्किट का पुनर्निर्माण करना संभव है। वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, जैसे सीरियल सेक्शन ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसएसईएम), सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीईएम), और केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एफआईबी-एसईएम) आमतौर पर न्यूरोनल सर्किट पुनर्निर्माण 3 के लिए उपयोग कियाजाताहै।
हमारे अध्ययनों में, एसबीईएम विधि को माउस हिप्पोकैम्पस और ऑर्गेनोइटिक ब्रेन स्लाइस 4, 5के नमूनों में डेंड्रिटिक कताई और पीएसडी की संरचनात्मक प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए सफलतापूर्वकनियोजितकिया गया है। एसबीईएम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप चैंबर 6 ,7,8,9केअंदर एक लघु अल्ट्रामाइक्रोटोम की स्थापना पर आधारित है । नमूना ब्लॉक के शीर्ष को चित्रित किया जाता है, और फिर नमूना अल्ट्रामाइक्रोटोपोम द्वारा एक निर्दिष्ट गहराई पर काटा जाता है, जो एक नए ब्लॉक-फेस का खुलासा करता है, जिसे फिर से इमेज किया जाता है और फिर प्रक्रिया8दोहराई जाती है। नतीजतन, केवल ब्लॉक-फेस की छवि बची है जबकि जो टुकड़ा काटा गया है वह मलबे के रूप में खो गया है। यही कारण है कि SBEM एक विनाशकारी तकनीक कहा जाता है, जिसका अर्थ है कि एक ही जगह को फिर से छवि करना संभव नहीं है। हालांकि, विनाशकारी ऑन-ब्लॉक विधियों का लाभ यह है कि वे विकृत समस्याओं और अनुभाग हानि से पीड़ित नहीं हैं जो डेटा गुणवत्ता और डेटा विश्लेषण3को काफी प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, SBEM उच्च संकल्प3पर अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र (> 0.5 मिमी × 0.5 मिमी) को छवि देने की संभावना देता है।
SBEM को नियोजित करने के लिए, नमूनों को छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के कारण एक समर्पित, अत्यधिक विषम प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए । हम यहां दिखाते हैं कि1 9 80 केदशकमें विकसित कम ऑस्मियम-थिओकार्बोहाइड्रेजाइड-ऑस्मिम (रोओटो) दाग का उपयोग करके डियरिंक 10 (नेशनल सेंटर फॉर माइक्रोस्कोपी एंड इमेजिंग रिसर्च (एनसीएमआईआर) विधि द्वारा विकसित प्रक्रिया के आधार पर प्रोटोकॉल के अनुसार नमूना तैयारी कैसेकरें। इसके अलावा, हम हल्के निर्धारण परफ्यूजन के साथ एक दो-चरण निर्धारण दृष्टिकोण पेश करते हैं जो हल्के माइक्रोस्कोपी और एसबीईएम के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के लिए एक ही मस्तिष्क का उपयोग करने की अनुमति देता है।
प्रोटोकॉल में एक माउस मस्तिष्क मुख्य रूप से एक हल्के फिक्सेटिव के साथ तय किया जाता है, और फिर हिस्सों में काट दिया जाता है, और एक गोलार्द्ध को इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के लिए पोस्टफिक्स और तैयार किया जाता है, जबकि दूसरा ईएम अध्ययन(चित्रा 1)के लिए।
चित्रा 1। SBEM के साथ विश्लेषण के लिए डेंड्रिटिक कताई की तैयारी के लिए वर्कफ्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चूहों का बलिदान किया गया था और एक हल्के प्राथमिक स्थिर के साथ छिद्रित किया गया था। मस्तिष्क को हिस्सों में काट दिया गया था, और एक गोलार्द्ध को इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के साथ पोस्टफिक्स किया गया था- समर्पित फिक्सेटिव, क्रायोप्रोटेक्टेड, क्रायोस्टेट का उपयोग करके कटा हुआ और यदि अध्ययन के लिए संसाधित किया गया था, जबकि दूसरे गोलार्द्ध को ईएम फिक्सेटिव के साथ पोस्टफिक्स किया गया था, वाइब्रेटोम के साथ कटा हुआ था और ईएम अध्ययन के लिए तैयार किया गया था। SBEM अध्ययन के लिए मस्तिष्क स्लाइस विपरीत थे, राल में एम्बेडेड फ्लैट, तो हिप्पोकैम्पस के एक CA1 क्षेत्र पिन करने के लिए मुहिम शुरू की थी, और SBEM(चित्रा 1)के साथ छवि ) । एक पीले बॉक्स में प्रकाश डाला प्रोटोकॉल का हिस्सा वीडियो में चित्रित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
201010में डियरिंक द्वारा वर्णित प्राथमिक एनसीआईआर विधि के कई रूप हैं। बुनियादी सिद्धांत एक ही रहते हैं, लेकिन, अध्ययन सामग्री के प्रकार के आधार पर, मामूली परिवर्तन लागू कर रहे हैं । यह पहले वर्णित…
The authors have nothing to disclose.
SBEM इमेजिंग, लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयारिंग इमेजिंग ऊतक और समारोह की प्रयोगशाला के उपकरणों के उपयोग के साथ किया गया जो प्रयोगात्मक जीव विज्ञान के Nencki संस्थान में एक इमेजिंग कोर सुविधा के रूप में कार्य करता है ।
चित्रा 1 की तैयारी के लिए, माउस (Souris_02) की छवि और https://smart.servier.com/ से एक शीशी का उपयोग किया गया था।
इस काम को केआर को दिए गए नेशनल साइंस सेंटर (पोलैंड) ग्रांट ओपस (यूएएम-2018/31/बी/NZ4/01603) ने सपोर्ट किया ।
Anesthetic: | |||
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Fixatives: | |||
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
Perfusion: | |||
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
Brain slices preparation for EM: | |||
12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
Brain slices preparation for IF: | |||
96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
Immunostaining: | |||
24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
Electron microsocpy sample preparation | |||
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
Specimen mounting for SBEM | |||
96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
Software | webpage | tutorials | |
FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
Animals | |||
Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |