检测蛋白质低洼构象状态的高压NMR实验
Summary
我们详细描述了组装高压电池所需的步骤，建立并记录了高压NMR实验，最后分析了压力下的峰值强度和化学移位变化。这些实验可以为蛋白质的折叠途径和结构稳定性提供有价值的见解。
Abstract
高压是一种众所周知的扰动方法，可用于破坏球状蛋白的稳定，并以可逆的方式分离蛋白质复合物。静水压力将热力学平衡推向摩尔体积较低的状态。因此，压力的增加提供了微调球蛋白稳定性和蛋白质复合物寡聚平衡的机会。高压NMR实验通过结合压力扰动的精细稳定性调谐能力和溶液NMR光谱提供的位点分辨率，对球蛋白稳定性、折叠机制和寡聚机制的因素进行了详细描述。在这里，我们提出了一个协议，通过一组从1巴记录到2.5千巴的2D 1H-15N实验来探索蛋白质的局部折叠稳定性。获取和分析此类实验所需的步骤用在 hnRNPA1 的 RRM2 域获得的数据来说明。
Introduction
人们早就认识到，高能量、稀疏的蛋白质和蛋白质复合物的构象状态在许多生物途径1、2、3中起着关键作用。由于基于卡尔-珀塞尔-梅布姆-吉尔（CPMG）4、化学交换饱和转移（CEST）5和暗态交换饱和转移（DEST）6脉冲序列（等）的实验，解决方案NMR光谱学已成为描述瞬态构象状态7的一种选择方法。除了这些实验，可以引入温度、pH值或化学变性剂等扰动，以增加高能量构象亚态的相对数量。同样，蛋白质平衡也可以通过施加高静水压力来扰乱。根据与相应的构象变化相关的体积变化的大小，压力增加几百到几千条可以显著稳定更高的能量状态或导致蛋白质完全展开8，9，10。蛋白质NMR光谱通常显示两种类型的水静压变化：（i） 化学转移变化和（ii） 峰值强度变化。化学移位变化反映了蛋白质地表水界面的变化和/或蛋白质结构的局部压缩在快速的时间尺度（相对于NMR时间尺度）11。表现出大型非线性化学转移压力依赖性的十字说可以表明存在较高的能量构象状态12，13。另一方面，峰值强度变化指向缓慢时间尺度上的主要构象过渡，例如折叠/展开状态人口的变化。折叠中间体或更高能量状态的存在可以从体积变化幅度的巨大变化中检测到，当展开测量给定蛋白质的不同残留物14，15，16，17。根据我们的经验，即使是通常被归类为两州文件夹的微小蛋白质，对压力的反应也不均匀，这为当地折叠稳定性提供了有用的信息。这里描述的是获取和分析中层峰值强度和1H化学转移压力依赖性的协议，用作模型蛋白的分离RNA识别主题2（RRM2）的异质核核核蛋白A1（hnRNPA1）。
Protocol
注：此处描述的协议要求 （i） 高压泵和电池具有 2.5 kbar 额定铝硬氧化锌管18，（ii）软件 SPARKY19 用于分析 NMR 光谱，（iii） 曲线拟合软件。 1. 样品制备、高压电池组装和设置实验。 缓冲器的选择：使用等离子和离子缓冲的混合物，如磷酸盐和三叶草20，21。注：磷酸盐和 MES 等电离子…
Representative Results
此处描述的协议用于调查 RRM2 的压力依赖性，RRM2 是 hnRNPA1 的第二个 RNA 识别主题（残留物 95-106），几乎完全展开于 2.5 kbar 范围内（>90%）。1H-15N光谱收集在1杆，500杆，750杆，1巴，1.5千巴，2公里，和2.5千巴（图2）。由于在2.5千巴的噪音水平以上看不到任何本地十字语，所有相应的残留物在这种压力下的强度值均为0（图3A）。根据方程 …
Discussion
这项研究详细介绍了一项旨在探测蛋白质结构和热力学对压力扰动的反应的协议。RRM2上记录的高压实验表明，在相对较小的单一领域蛋白质中，可以发现+VU值的巨大变化，表明非完全合作展开。分析压力下的1H化学移位变化时，也出现了类似的情况。应当指出，卡尔比策和同事已经证明，可以对化学移位变化进行更深入的分析，将非线性和线性系数（B2/B1）与可压…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了罗伊·卡弗慈善信托基金和朱利安·罗氏基金的支持。我们感谢J.D.莱文古德和B.S.托尔伯特提供RRM2样本。
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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High-pressure NMRProtein Conformational StatesPressure PerturbationGlass CavitiesVoid VolumesNitrogen-15-labeled SampleMineral OilTransmission LiquidPressure Cell AssemblyTransverse Relaxation Optimized SpectroscopyHetero Single-quantum Coherence SpectroscopyFolding/unfolding RatesRRM2Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1
Citar este artigo
Nguyen, T. T., Siang, S., Roche, J. High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States. J. Vis. Exp. (172), e62701, doi:10.3791/62701 (2021).