En las últimas dos décadas, los métodos basados en fluorescencia de una sola molécula se han convertido en una poderosa herramienta para medir biomoléculas^1,2,sondeando cómo se distribuyen los diferentes parámetros biomoleculares, así como cómo se interconvierten dinámicamente entre diferentes subtensiones de estos parámetros a una resolución de menos de milisegundos^3,4,5. Los parámetros en estas técnicas incluyen la eficiencia de transferencia de energía en las mediciones FRET ^6,7,anisotropía de fluorescencia^8,9,rendimientos cuánticos de fluorescencia y vidas^{útiles 10,11,}en función de diferentes mecanismos de enfriamiento de fluorescencia¹² o mejora^13. Uno de estos mecanismos, más conocido como mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE)¹⁴ introduce la mejora del rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida útil en función de la obstrucción estérica a la isomerización libre del fluoróforo cuando está en estado excitado, causada por superficies de proteínas en las cercanías del colorante^{14,15,16,17,18,19} . Tanto FRET como PIFE se consideran reglas espectroscópicas o sensores de proximidad, ya que su parámetro medido está directamente relacionado con una medida espacial dentro de la biomolécula etiquetada bajo medición. Mientras que la eficiencia FRET está relacionada con la distancia entre un par de colorantes dentro de un rango de 3-10 nm^20,PIFE rastrea aumentos en los rendimientos cuánticos de fluorescencia o vidas útiles relacionadas con la distancia entre el tinte y una superficie de una proteína cercana en el rango de 0-3 nm¹⁹.

El FRET de molécula única se ha utilizado ampliamente para proporcionar información estructural sobre muchos sistemas de proteínas diferentes, incluidas las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs)²¹, como la α-Sinucleína (α-Syn)²². α-Syn puede formar estructuras ordenadas después de la unión a diferentes biomoléculas y bajo diferentes condiciones^23,24^{,25,26,27,28,29,30}. Sin embargo, cuando no está unido, el monómero α-Syn se caracteriza por una alta heterogeneidad conformacional con conformaciones que se interconvierten rápidamente^31,32.

Las conformaciones de α-Syn han sido estudiadas previamente utilizando diversas técnicas diferentes que ayudan a identificar dinámicas conformacionales de tales sistemas proteicos altamente heterogéneos y dinámicos^{33,34 , 35,36,37,38,39}. Curiosamente, las mediciones fret de una sola molécula (smFRET) de α-Syn en tampón informaron una sola población fret^39,40 que es el resultado del promedio de tiempo de conformaciones que se interconvierten dinámicamente a veces mucho más rápido que el tiempo de difusión típico de α-Syn a través del punto confocal (tiempos tan rápidos como pocos microsegundos e incluso más rápido que eso, en relación con los tiempos de difusión típicos de milisegundos)^{40, 41}. Sin embargo, el uso de una regla espectroscópica FRET con la sensibilidad de distancia de 3-10 nm a veces informa solo sobre los cambios estructurales generales en una proteína pequeña como α-Syn. Las mediciones de una sola molécula que utilizan sensores de proximidad espectroscópicos con sensibilidades de distancia más cortas tienen el potencial de informar sobre la dinámica de las estructuras locales. Aquí realizamos mediciones PIFE de una sola molécula de α-Syn e identificamos diferentes sub-poblaciones de vidas de fluorescencia mapeando diferentes estructuras locales con transiciones entre ellas tan lentas como 100 ms. Este trabajo resume las mediciones smPIFE resueltas en el tiempo de moléculas de α-Syn de difusión libre de una en una, en tampón y cuando se unen a membranas basadas en SDS como un sensor de proximidad espectroscópico de molécula única de corto alcance.