За последние два десятилетия одномолекулярные флуоресцентные методы стали мощным инструментом для измерения биомолекул^1,2,исследования того, как распределяются различные биомолекулярные параметры, а также как они динамически взаимоконвертируются между различными субопциплонатами этих параметров при субмиллисекундном разрешении^3,4,5. Параметры в этих методах включают эффективность передачи энергии в измерениях ^{FRET 6,7,}флуоресцентную анизотропию^8,9,квант флуоресценции и время жизни^10,11,как функцию различных флуоресцентных гасящих¹² или¹³ улучшений механизмов. Один из этих механизмов, более известный как белково-индуцированное флуоресцентное усиление (PIFE)^14, вводит увеличение квантового выхода флуоресценции и времени жизни в функции стерической обструкции к свободной изомеризации флуорофора в возбужденном состоянии, вызванном белковыми поверхностями в непосредственной близости от красителя^{14,15,16,17,18,19} . Как FRET, так и PIFE считаются спектроскопическими линейками или датчиками приближения, поскольку их измеряемый параметр напрямую связан с пространственной мерой в меченой биомолекуле при измерении. В то время как эффективность FRET связана с расстоянием между парой красителей в диапазоне 3-10 нм^20,треки PIFE увеличивают квантовые выходы флуоресценции или время жизни, связанное с расстоянием между красителем и поверхностью соседнего белка в диапазоне 0-3 нм^19.

Одномолекулярный FRET широко используется для обеспечения структурного понимания многих различных белковых систем, включая внутренне неупорядоженные белки (IMP)^21,такие как α-synuclein (α-Syn)^22. α-Syn может образовывать упорядоченные структуры после связывания с различными биомолекулами и в разных условиях^{23,24,25, 26,27,28,29,30.} Однако при несвязывке мономер α-Syn характеризуется высокой конформационной гетерогенностью с быстро взаимоконвертируемыми конформациями^31,32.

Конформации α-Syn были изучены ранее с использованием различных методов, которые помогают в выявлении конформационной динамики таких высоко гетерогенных и динамических белковых систем^{33,34,35,36,37,38,39.} Интересно, что одномолекулярные измерения FRET (smFRET) α-Syn в буфере сообщили об одной популяции FRET^39,40, что является результатом усреднения по времени конформаций, динамически взаимопреобразующихся в разы намного быстрее, чем типичное время диффузии α-Syn через конфокальное пятно (в разы быстрее, чем несколько микросекунд и даже быстрее, чем это, относительно типичного миллисекундного времени диффузии)^{40, 41}г. Однако использование спектроскопической линейки FRET с чувствительностью расстояния 3-10 нм иногда сообщает только об общих структурных изменениях в небольшом белке, таком как α-Syn. Одномолекулярные измерения с использованием спектроскопических датчиков приближения с более короткой чувствительностью расстояния могут сообщить о динамике локальных структур. При этом мы выполняем одномолекулярные измерения PIFE α-Syn и идентифицируем различные субпопущенности флуоресцентных жизней, отображающих различные локальные структуры с переходами между ними медленно до 100 мс. В этой работе обобщены измерения smPIFE со временным разрешением свободно диффундируемых молекул α-Syn по одной, в буфере и при связываниях с мембранами на основе SDS в качестве одномолекулярного спектроскопического датчика приближения малого диапазона.