Negli ultimi due decenni, i metodi basati sulla fluorescenza a singola molecola sono diventati un potente strumento per misurare le biomolecole^1,2,sondando come si distribuiscono i diversi parametri biomolecolari e come si interconvertono dinamicamente tra diverse sotto-popolazioni di questi parametri a risoluzione inferiore al millisecondo^3,4,5. I parametri in queste tecniche includono l’efficienza di trasferimento di energia nelle misure FRET ^6,7,l’anisotropia di fluorescenza^8,9,i rendimenti quantistici di fluorescenza e le durate^10,11,in funzione di diversi meccanismi di tempra^{fluorescenza 12} o di potenziamento^13. Uno di questi meccanismi, meglio noto come protein-induced fluorescence enhancement (PIFE)¹⁴ introduce il potenziamento della resa quantistica e della durata della fluorescenza in funzione dell’ostruzione sterica all’isomerizzazione libera del fluoroforo quando in stato eccitato, causata da superfici proteiche in prossimità del colorante^{14,15,16,17,18,19} . Sia FRET che PIFE sono considerati righelli spettroscopici o sensori di prossimità poiché il loro parametro misurato è direttamente collegato a una misura spaziale all’interno della biomolecola etichettata in fase di misurazione. Mentre l’efficienza FRET è correlata alla distanza tra una coppia di coloranti entro un intervallo di 3-10 nm²⁰, PIFE traccia aumenti delle rese quantistiche di fluorescenza o della durata di vita legate alla distanza tra il colorante e una superficie di una proteina vicina nell’intervallo di 0-3 nm¹⁹.

La FRET a singola molecola è stata ampiamente utilizzata per fornire informazioni strutturali su molti sistemi proteici diversi, tra cui proteine intrinsecamente disordinate (IDP)²¹, come α-Sinucleina (α-Syn)²². α-Syn può formare strutture ordinate in seguito al legame a diverse biomolecole e in diverse condizioni^{23,24,25,26,27,28,29,30.} Tuttavia, quando non legato, il monomero α-Syn è caratterizzato da un’elevata eterogeneità conformazionale con conformazioni rapidamente interconvertite^31,32.

Le conformazioni di α-Syn sono state studiate in precedenza utilizzando varie tecniche diverse che aiutano a identificare la dinamica conformazionale di tali sistemi proteici altamente eterogenei e dinamici^{33,34,35,36,37,38,39.} È interessante notare che le misurazioni FRET a singola molecola (smFRET) di α-Syn nel buffer hanno riportato una singola popolazione FRET^39,40 che è il risultato della media temporale delle conformazioni che si interconvertono dinamicamente a volte molto più velocemente del tempo di diffusione tipico di α-Syn attraverso il punto confocale (tempi veloci come pochi microsecondi e anche più veloci di quello, rispetto ai tipici tempi di diffusione al millisecondo)^{40, 41}. Tuttavia, l’uso di un righello spettroscopico FRET con la sensibilità alla distanza di 3-10 nm a volte riporta solo i cambiamenti strutturali complessivi in una piccola proteina come α-Syn. Le misurazioni a singola molecola che utilizzano sensori di prossimità spettroscopici con sensibilità a distanza più breve hanno il potenziale per riferire sulla dinamica delle strutture locali. Qui eseguiamo misurazioni PIFE a singola molecola di α-Syn e identifichiamo diverse sotto-popolazioni di vite di fluorescenza mappate a diverse strutture locali con transizioni tra loro lente fino a 100 ms. Questo lavoro riassume le misurazioni smPIFE risolte nel tempo di molecole α-Syn a diffusione libera una alla volta, in buffer e quando legate a membrane basate su SDS come sensore di prossimità spettroscopico a singola molecola a corto raggio.