Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Einzelmolekül-Fluoreszenz-basierte Methoden zu^einemleistungsfähigen Werkzeug zur Messung von Biomolekülen 1 ,^2entwickelt,um zu untersuchen, wie sich verschiedene biomolekulare Parameter verteilen und wie sie dynamisch zwischen verschiedenen Subpopulationen dieser Parameter mit einer Auflösung von submillisekunden^3,4,5interkonvertieren. Die Parameter in diesen Techniken umfassen die Energieeffizienz in den FRET-Messungen ⁶,⁷, Fluoreszenzanisotropie^8,9, Fluoreszenzquantenausbeuten und^{Lebensdauern 10,11}, als Funktion verschiedener Fluoreszenzlöschungsmechanismen¹² oder^{Verstärkung 13.} Einer dieser Mechanismen, besser bekannt als proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung (PIFE)^14, führt die Verbesserung der Fluoreszenzquantenausbeute und -lebensdauer als Funktion der sterischen Obstruktion der freien Isomerisierung des Fluorophors im angeregten Zustand ein, verursacht durch Proteinoberflächen in der Nähe des Farbstoffs^{14,15,16,17,18,19} . Sowohl FRET als auch PIFE gelten als spektroskopische Lineale oder Näherungssensoren, da ihr gemessener Parameter direkt mit einer räumlichen Messung innerhalb des markierten zu messenden Biomoleküls verbunden ist. Während die FRET-Effizienz mit dem Abstand zwischen einem Farbstoffpaar in einem Bereich von 3-10 nm²⁰zusammenhängt, verfolgt PIFE Erhöhungen der Fluoreszenzquantenausbeuten oder Lebensdauern in Bezug auf den Abstand zwischen dem Farbstoff und einer Oberfläche eines nahe gelegenen Proteins im Bereich von 0-3 nm¹⁹.

Einzelmolekül-FRET wurde häufig verwendet, um strukturelle Einblicke in viele verschiedene Proteinsysteme zu geben, einschließlich intrinsisch ungeordneter Proteine (IDPs)^21,wie α-Synuclein (α-Syn)²². α-Syn kann nach Bindung an verschiedene Biomoleküle und unter verschiedenen^{Bedingungen geordnete}Strukturen bilden 23^{,24,25,26,27,28,29,30}. Wenn es jedoch ungebunden ist, zeichnet sich das α-Syn-Monomer durch eine hohe Konformationsheterogenität mit schnell ineinander überlagernden Konformationen^{aus 31,32}.

Die Konformationen von α-Syn wurden zuvor mit verschiedenen Techniken untersucht, die bei der Identifizierung der Konformationsdynamik solcher hochheterogenen und dynamischen Proteinsysteme^{helfen 33,34,35,36,37,38,39}. Interessanterweise ergaben Einzelmolekül-FRET-Messungen (smFRET) von α-Syn im Puffer eine einzelne FRET-Population^39,40, die ein Ergebnis der Zeitmittelung von Konformationen ist, die sich manchmal viel schneller als die typische Diffusionszeit von α-Syn durch den konfokalen Punkt dynamisch interkonvertieren (mal so schnell wie wenige Mikrosekunden und sogar schneller als das, relativ zu typischen Millisekunden-Diffusionszeiten)^{40, 41}. Die Verwendung eines SPEKT-SPEKT-Lineals mit der Entfernungsempfindlichkeit von 3-10 nm berichtet jedoch manchmal nur über allgemeine strukturelle Veränderungen in einem kleinen Protein wie α-Syn. Einzelmolekülmessungen mit spektroskopischen Näherungssensoren mit kürzeren Entfernungsempfindlichkeiten haben das Potenzial, über die Dynamik lokaler Strukturen zu berichten. Hierin führen wir Einzelmolekül-PIFE-Messungen von α-Syn durch und identifizieren verschiedene Subpopulationen von Fluoreszenzlebenszeiten, die auf verschiedene lokale Strukturen mit Übergängen zwischen ihnen von bis zu 100 ms abgebildet sind. Diese Arbeit fasst zeitaufgelöste smPIFE-Messungen von frei diffundierenden α-Syn-Molekülen einzeln, in Puffer und gebunden an SDS-basierte Membranen als SDS-basierten Einzelmolekül-Näherungssensor mit kurzer Reichweite zusammen.