I løbet af de sidste to årtier er fluorescensbaserede metoder med enkeltmolekyler blevet et kraftfuldt værktøj til måling af biomolekyler^1,2, hvilket undersøger, hvordan forskellige biomolekylære parametre fordeler^sig,samt hvordan de dynamisk interkonverterer mellem forskellige underpopulationer af disse parametre ved sub millisekunders opløsning^3,4,⁵. Parametrene i disse teknikker omfatter energieffektivitet i FRET målinger ^6,7, fluorescens anisotropi^8,9, fluorescens quantum udbytter og^{levetider 10,11}, som en funktion af forskellige fluorescens slukke¹² eller ekstraudstyr¹³ mekanismer. En af disse mekanismer, bedre kendt som protein-induceret fluorescens ekstraudstyr (PIFE)¹⁴ introducerer forbedring af fluorescens quantum udbytte og levetid som en funktion af sterisk obstruktion til fri isomerisering af fluorophore når i ophidset tilstand, forårsaget af proteinoverflader i nærheden af farvestoffet^{14,15,16,17,18,19} . Både FRET og PIFE betragtes som spektroskopiske linealer eller nærhedssensorer, da deres målte parameter er direkte forbundet med en rumlig foranstaltning inden for den mærkede biomolekyle under måling. Mens FRET-effektiviteten er relateret til afstanden mellem et par farvestoffer inden for en rækkevidde på 3-10 nm²⁰, øger PIFE-spor i fluorescens quantum udbytter eller levetider relateret til afstanden mellem farvestoffet og en overflade af et nærliggende protein i intervallet 0-3 nm¹⁹.

Enkeltmolekyle FRET har været meget udbredt til at give strukturel indsigt i mange forskellige proteinsystemer, herunder iboende uorganiseret proteiner (IIV’er)²¹, såsom α-Synuclein (α-Syn)²². α-Syn kan danne ordnede strukturer efter binding til forskellige biomolekyler og under forskellige forhold^{23,24,25,26,27,28,29,30}. Men når den er ubundet, er α-Syn-monomer karakteriseret ved høj kropsbygnings heterogenitet med hurtigt interkonverterende konformationer^31,32.

Overensstemmelserne mellem α-Syn er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af forskellige teknikker, der hjælper med at identificere kropsbygningsdynamikken i sådanne meget heterogene og dynamiske proteinsystemer^{33,34,35,36,37,38,39}. Interessant, enkelt-molekyle FRET (smFRET) målinger af α-Syn i buffer rapporterede en enkelt FRET befolkning^39,40, der er et resultat af tid-gennemsnit af konformationer dynamisk interkonvertere til tider meget hurtigere end den typiske diffusion tid α-Syn gennem confocal stedet (gange så hurtigt som få mikrosekunder og endnu hurtigere end det, i forhold til typiske millisekunder diffusion gange)^{40, 41}. Men ved hjælp af en FRET spektroskopisk lineal med 3-10 nm afstand følsomhed undertiden rapporterer kun om generelle strukturelle ændringer i et lille protein som α-Syn. Målinger med enkeltmolekyler, der anvender spektroskopiske nærhedssensorer med kortere afstandsfølsomhed, har potentiale til at rapportere om dynamikken i lokale strukturer. Heri udfører vi enkeltmolekylet PIFE-målinger af α-Syn og identificerer forskellige underpopulationer af fluorescens levetid kortlægning til forskellige lokale strukturer med overgange mellem dem så langsomt som 100 ms. Dette arbejde opsummerer tidsforbestemte smPIFE-målinger af frit diffuserende α-Syn-molekyler en ad gangen, i buffer og når de er bundet til SDS-baserede membraner som en kortrækkende enkeltmolekylespektroskopisk nærhedssensor.