Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer
Summary
Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein’deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Abstract
Tek biyomoleküllerin ve dinamiklerinin birden fazla konformasyonunu izlemek için spektroskopik cetvellerin kullanılması, yapısal dinamiklerin anlaşılmasında ve biyolojiye katkılarında devrim yaratmasına neden oldu. FRET tabanlı cetvel 3-10 nm aralığındaki boyalar arası mesafeleri raporlarken, protein kaynaklı floresan geliştirme (PIFE) gibi diğer spektroskopik teknikler, daha kısa 0-3 nm aralığında bir boya ile protein yüzeyi arasındaki yakınlığı rapor eder. Tercih yöntemi ne olursa olsun, serbestçe dağılan biyomolekülleri teker teker ölçmedeki kullanımı, deneysel parametrenin histogramlarını alarak, her alt popülasyonun milisaniyeler içinde değişmeden kalan tek bir uyumu veya milisaniyeden çok daha hızlı bir şekilde kesişen birden fazla uyumu ve dolayısıyla ortalama bir alt popülasyonu temsil ettiği ayrı merkezi olarak dağıtılmış biyomolekül alt popülasyonlarını verir. Histogramlarda bildirilen parametrenin inter-boya FRET verimliliği olduğu tek moleküllü FRET’te, tampondaki α-Synuclein monomer gibi özünde düzensiz bir proteinin, daha önce hızla birbirine keneşen birden fazla konfektörden oluşan tek bir ortalama alt popülasyon sergilediği bildirilmiştir. Bu geçmiş bulgular FRET tabanlı cetvelin 3-10 nm aralığına bağlı olsa da, bu proteini, mekâna özgü sCy3 etiketli α-Synuclein proteinlerinin floresan ömrünü tek tek izlediğimiz tek moleküllü PIFE kullanarak test etmeye çalıştık. İlginçtir ki, bu daha kısa menzilli spektroskopik yakınlık sensörunu kullanarak, sCy3 etiketli α-Synuclein, 10-100 ms’de kesişen belirgin şekilde farklı ortalama ömürlere sahip birkaç ömür boyu alt popülasyon sergiler. Bu sonuçlar, α-Synuclein’in küresel olarak düzensiz olabileceğini, ancak yine de istikrarlı yerel yapılara sahip olduğunu göstermektedir. Özetle, bu çalışmada, yerel veya küresel yapısal değişiklikleri aynı anda bir biyomolekülden izleyen farklı spektroskopik yakınlık sensörleri kullanmanın avantajını vurguluyoruz.
Introduction
Son yirmi yılda, tek moleküllü floresan bazlı yöntemler biyomolekülleri ölçmek için güçlü bir araçhalinegelmiştir 1,2, farklı biyomoleküler parametrelerin nasıl dağılacağını ve bu parametrelerin farklı alt popülasyonları arasında milisaniyenin altında çözünürlük 3 , 4,5arasında dinamik olarak nasıl bir araya geldiklerini yoklar. Bu tekniklerdeki parametreler, FRET ölçümlerinde enerji transfer verimliliğini içerir 6,7, floresan anizotropi8,9, floresan kuantum verimleri ve ömürleri10,11, farklı floresan söndürme bir fonksiyon olarak12 veya geliştirme13 mekanizmaları. Protein kaynaklı floresan geliştirme (PIFE) 14 olarak bilinen bu mekanizmalardan biri,14, 15 , 16 ,17,18,19 boyasının çevresindeki protein yüzeylerinin neden olduğu, heyecan verici durumdayken floroforun serbest izomerizasyonunasteriktıkanıklığın bir işlevi olarak floresan kuantum veriminin ve ömrünün artırılmasınıtanıtır. . Hem FRET hem de PIFE spektroskopik cetveller veya yakınlık sensörleri olarak kabul edilir, çünkü ölçülen parametreleri ölçüm altında etiketli biyomolekül içindeki uzamsal bir ölçüye doğrudan bağlıdır. FRET verimliliği 3-10 nm20aralığındaki bir çift boya arasındaki mesafe ile ilgili olsa da, PIFE izleri floresan kuantum veriminde veya 0-3 nm19aralığındaki yakındaki bir proteinin yüzeyi arasındaki mesafe ile ilgili yaşam sürelerinde artar.
Tek moleküllü FRET, α-Synuclein (α-Syn) 22 gibi özünde düzensiz proteinler (IDP’ler)21de dahil olmak üzere birçokfarklı protein sistemine yapısal içgörüler sağlamak için yaygın olarak kullanılmıştır. α-Syn, farklı biyomoleküllere ve farklı koşullar altında 23 , 24 , 25 ,26,27,28,29,30’abağlanarak sıralı yapılar oluşturabilir. Bununla birlikte, ilişkisiz olduğunda, α-Syn monomer, hızla birbirine keneşen konformasyonlarla yüksek konformasyonlu heterojenlik ile karakterize edilir31,32.
α-Syn’nin konformasyonları daha önce, bu tür yüksek heterojen ve dinamik protein sistemlerinin konformasyonsal dinamiklerinin belirlenmesine yardımcı olan çeşitli farklı teknikler kullanılarak çalışılmıştır33,34,35,36,37,38,39. İlginçtir ki, tampondaki α-Syn’nin tek moleküllü FRET (smFRET)ölçümleri,konfokal nokta aracılığıyla α-Syn’nin tipik difüzyon zamanından çok daha hızlı zaman zaman dinamik olarak kesişen konfeksiyonların zaman ortalamasının bir sonucu olan tek bir FRET popülasyonu39,40 bildirdi (birkaç mikrosaniye kadar hızlı ve hatta bundan daha hızlı, tipik milisaniye difüzyon sürelerine göre)40, 41. Bununla birlikte, 3-10 nm mesafe hassasiyetine sahip bir FRET spektroskopik cetveli kullanmak bazen sadece α-Syn gibi küçük bir proteindeki genel yapısal değişiklikleri raporlar. Daha kısa mesafe hassasiyetlerine sahip spektroskopik yakınlık sensörlerini kullanan tek moleküllü ölçümler, yerel yapıların dinamiklerini raporlama potansiyeline sahiptir. Burada α-Syn’nin tek moleküllü PIFE ölçümlerini gerçekleştiriyor ve floresan ömürlerinin farklı alt popülasyonlarını, aralarında 100 ms kadar yavaş geçişlerle farklı yerel yapılara eşleşiyor. Bu çalışma, serbestçe dağılan α-Syn moleküllerinin zaman çözümlenmiş smPIFE ölçümlerini birer birer, tamponda ve SDS tabanlı membranlara kısa menzilli tek moleküllü spektroskopik yakınlık sensörü olarak bağlandığında özetlemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
α-Syn’nin yapısal özelliklerini ve düzensiz doğasını incelemek için kapsamlı biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar yapıldı33,34,35,36,37,38. Α-Syn monomerinin bağdan arındırılmış moleküler içi dinamiklerini araştırmak için birçok çalışma serbestçe dağıtıcı smFRET’i kullanmıştır. Bu çal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PT-t7 plazmid kodlu A56C α-Syn mutant bize Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir ve Dr. Elisha Haas tarafından hediye edildi. Bu makale Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH, R01 GM130942’yi E.L.’ye subaward olarak vermek), İsrail Bilim Vakfı (KillCorona – Curbing Coronavirus Araştırma Programı dahilinde 3565/20 hibe), Milner Fonu ve Kudüs İbrani Üniversitesi (başlangıç fonları) tarafından desteklendi.
Materials
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merc | C7715 | cutoff: 100 kDa |
| ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube | Gene Bio-Application | MEGA320 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fast SeeBand staining solution | Gene Bio-Application | SB050 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| HiTrap Desalting 5 mL | Sigma-Aldrich | GE17-1408 | |
| 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich | L3152 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | |
| MonoQ column | Sigma-Aldrich | 54807 | |
| protein LoBind tube | Sigma-Aldrich | EP0030108094 | 0.5 mL |
| Rinse a µ-slide 18 | Ibidi | 81816 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 | |
| Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas | mini-plast | 815-004-05-001 | |
| streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| sulfo-Cy3 maleimide | abcam | ab146493 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | 75259 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 93363 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Referências
- Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
- Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
- Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
- Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
- Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
- Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
- Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
- Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
- Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
- Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Bioquímica. 10 (17), 3254-3263 (1971).
- Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
- Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
- Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
- Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
- Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
- Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
- Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
- Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
- Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
- Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
- Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
- Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
- Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Bioquímica. 48 (11), 2304-2306 (2009).
- Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
- Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
- Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
- Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
- Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
- Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
- Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature?. Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
- Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
- Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
- Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
- Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
- Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
- Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie – International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
- Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
- Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
- Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
- Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
- Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
- Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
- Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
- Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
- Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
- Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
- Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
- Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
- Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
- Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
- Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
- Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
- Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
- Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).
