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Bioquímica

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Published: May 30, 2021
doi:
10.3791/62655
,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus,The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

Abstract

분광 눈금을 사용하여 단일 생체 분자와 역학의 여러 적합성을 추적함으로써 구조적 역학에 대한 이해와 생물학에 대한 기여에 혁명을 일으켰습니다. FRET 기반 눈금자는 3-10 nm 범위에서 염료 간 거리에 대해 보고하는 동안, 단백질 유발 형광 향상(PIFE)과 같은 다른 분광 기술, 짧은 0-3 nm 범위에서 염료와 단백질 표면 사이의 근접성에 대한 보고. 선택의 방법에 관계없이, 한 번에 하나씩 자유롭게 확산되는 생체 분자를 측정하는 데 사용하는 것은 각 하위 집단이 밀리초 이내에 변경되지 않은 단일 형태 또는 밀리초보다 훨씬 빠르게 상호 변환되는 다중 적합성을 나타내는 생체 분자의 분리된 중앙 분산 하위 집단을 산출하는 실험 파라미터의 히스토그램을 검색합니다. 히스토그램에 보고된 파라미터가 염료 FRET 효율인 단일 분자 FRET에서, 완충제의 α-시뉴클레인 단조근과 같은 본질적으로 무질서한 단백질은 이전에 빠르게 상호 변환하는 다중 적합성의 단일 평균 아웃 하위 집단을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 과거 발견은 FRET 기반 통치자의 3-10 nm 범위에 의존하는 동안, 우리는 우리가 사이트 특정 sCy3 표지 α-시뉴클레인 단백질의 형광 수명을 추적 단일 분자 PIFE를 사용하여 테스트에이 단백질을 넣어 하고자 한 번에 하나씩. 흥미롭게도, 이 짧은 범위 분광 근접 센서를 사용하여, sCy3 표지 α-Synuclein는 10-100 ms에서 상호 변환하는 명백하게 다른 평균 수명을 가진 몇몇 일생 하위 인구를 전시합니다. 이러한 결과는 α-시뉴클레인이 전 세계적으로 무질서할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 안정적인 지역 구조를 달성한다는 것을 보여줍니다. 요약하자면, 이 작품에서는 한 번에 하나의 생체 분자를 로컬 또는 글로벌 구조 변화를 추적하는 다양한 분광 근접 센서를 사용하는 이점을 강조합니다.

Introduction

지난 2년간, 단일 분자 형광계 방법은 생체 분자1,2,다른 생체 분자 파라미터가 어떻게 분포되는지뿐만 아니라 하위 밀리초 해상도3,4,5에서이러한 매개 변수의 상이한 하위 집단 간에 동적으로 상호 작용하는 방법을 탐구하는 강력한 도구가 되었다. 이러한 기술의 파라미터는 FRET 측정 6,7,형광 이소트로피8,9,형광 양자 수율 및 수명10,11에서에너지 전달 효율을 포함하며, 12 또는 개선 된13 메커니즘의 상이한 형광의 함수로서. 단백질 유발 형광 향상(PIFE) (PIFE)(PIFE) 14는 염료14,15,16,18,18, 18, 18, 18의 부근의 단백질 표면에 의해 유발된 흥분 상태에서 형광의 자유 이소성 화에 대한 비질 방해의 함수로서 형광 양자 수율 및 수명의 향상을 소개합니다. . FRET와 PIFE 는 측정된 파라미터가 측정 중인 표지된 생체 분자 내의 공간 측정에 직접 연결되기 때문에 분광 눈금자 또는 근접 센서로 간주됩니다. FRET 효율은 3-10 nm20범위 내에서 염료 쌍 사이의 거리와 관련이 있지만, PIFE 트랙은 0-3 nm19범위내에서 염료와 인근 단백질의 표면 사이의 거리와 관련된 형광 양자 수율 또는 수명이 증가한다.

단일 분자 FRET는 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)(21) (21)예를 들어, α-시뉴클레인(α-Syn)(22)와같은 많은 다른 단백질 시스템에 대한 구조적 통찰력을 제공하는 데 널리 사용되어 왔다. α-신은 상이한 생체분자에 결합하고 상이한 조건하에서23,24,25,26,27,28,29,30의상이한 조건하에서 정렬된 구조를 형성할 수 있다. 그러나, 결합되지 않은 경우, α-Syn 단백체는 빠르게 상호 변환적합성(31,32)과높은 형태 이질성을 특징으로 한다.

α-Syn의 적합성은 이전에 이러한 고이질 및 동적 단백질 시스템의 형성 역학을 식별하는 데 도움이 되는 다양한 기술을 사용하여 연구되었으며,33,34,35,36,37,38, 39. 흥미롭게도, 완충제에서 α-Syn의 단일 분자 FRET(smFRET) 측정은 단일 FRET 인구39,40을 보고한결과,이는 공초점 지점을 통해 α-Syn의 일반적인 확산 시간보다 훨씬 빠른 시간에 동적으로 상호 변환되는 적합성의 시간 평균 결과이며(보통 보다 적은 마이크로초, 심지어 는 그보다 빠른40배) 41. 그러나, 3-10 nm 거리 감도를 가진 FRET 분광 눈금자를 사용하여 때때로 α-Syn과 같은 작은 단백질의 전반적인 구조 적 변화에 대해서만 보고합니다. 거리 민감도가 짧은 분광 근접 센서를 활용한 단일 분자 측정은 현지 구조물의 역학에 대해 보고할 가능성이 있습니다. 본명 에서 우리는 α-Syn의 단일 분자 PIFE 측정을 수행하고 100 ms만큼 느린 그들 사이의 전환과 다른 지역 구조에 매핑 형광 수명의 다른 하위 집단을 식별합니다. 이 작업은 버퍼에서 자유 확산 α-Syn 분자의 시간 해결 된 smPIFE 측정을 요약하고 단거리 단일 분자 분광 근접 센서로서 SDS 기반 멤브레인에 바인딩될 때.

Protocol

1. 플라스미드 변환 SOC 배지 0.5 L 준비 트라이프톤 10g, 효모 추출물 2.5g, 염화나트륨 0.25g(NaCl), 염화칼륨 0.1g(KCl)의 무게를 측정합니다. 총 부피가 0.5L까지 이중 증류수(DDW)를 추가합니다. 수산화 나트륨(NaOH)을 추가하여 pH 7에 적응합니다. 100mL 및 오토클레이브의 주식 알리쿼트를 준비합니다. 사용하기 전에 멸균 마그네슘 염화물(MgCl2)과1.8mL의 멸…

Representative Results

IDP로서, 다른 생체 분자에 바인딩되지 않을 때, α-Syn은 몇 마이크로초40에서, 심지어 수백 나노초41에서전이와 함께 다중 적합성 사이의 구조적 역학을 나타낸다. α-Syn이 공초점 지점을 교차하면 적합성 간에 수천 번의 전환이 발생할 수 있습니다. 실제로, 이것은 smFRET가39,40을사용했을 때의 경우였습니다. 여기서 우?…

Discussion

광범위한 생화학 적 및 생물리 연구는 α 신과 그 무질서한 자연33,34,35,36,37,38의구조적 특성을 연구하기 위해 수행되었다. 여러 작품은 이미 자유롭게 확산 smFRET를 활용하여 결합이 없는 α-Syn 단조량의 분자 내 역학을 조사합니다. 이러한 작품들은 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A56C α-Syn 돌연변이를 코딩하는 pT-t7 플라스미드는 아사프 그루피 박사, 댄 아미르 박사, 엘리샤 하스 박사의 선물로 우리에게 주어졌습니다. 이 논문은 국립 보건원 (NIH, 보조금 R01 GM130942 E.L. 하위 상으로), 이스라엘 과학 재단 (보조금 3565/20 킬코로나 내에서 – 코로나 바이러스 연구 프로그램을 억제), 밀너 기금과 예루살렘히브리어 대학 (시작 기금).

Materials

Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625
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Referências

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Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).
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